高立戰(zhàn),劉 軍,趙學(xué)前,孫 棟,姜 力,孫 洋,祝令偉,馮書章*

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所,吉林長春 130062;2.吉林省通化縣動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心,吉林通化 134100;3.吉林省獸醫(yī)科學(xué)研究所,吉林長春 130062)

犢牛腹瀉主要病原菌多重PCR方法的建立*

高立戰(zhàn)1,劉 軍1,趙學(xué)前2,孫 棟2,姜 力3,孫 洋1,祝令偉1,馮書章1*

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所,吉林長春 130062;2.吉林省通化縣動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心,吉林通化 134100;3.吉林省獸醫(yī)科學(xué)研究所,吉林長春 130062)

產(chǎn)毒性大腸埃希菌、A/E大腸埃希菌和沙門菌是造成犢牛腹瀉的主要病原菌。選取產(chǎn)毒性大腸埃希菌的st和lt基因、A/E大腸埃希菌的eae基因和沙門菌的invA基因作為擴(kuò)增靶基因序列,通過優(yōu)化反應(yīng)條件建立了四重PCR檢測體系。對PCR產(chǎn)物回收、測序,驗(yàn)證PCR。通過特異性試驗(yàn)和敏感性試驗(yàn)證明該P(yáng)CR體系特異性強(qiáng)、敏感性高,可有效地檢測犢牛腹瀉病原菌。使用該四重PCR檢測22份臨床樣品,發(fā)現(xiàn)其中9份攜帶相關(guān)基因,并分離得到了相關(guān)致病菌。

大腸埃希菌;沙門菌;多重PCR

犢牛腹瀉是指新生以及斷乳期的犢牛所發(fā)生的一種急性腹瀉,主要由腸道病原菌引起,其次病毒、寄生蟲等病原體或者是營養(yǎng)性和環(huán)境性因素也可以導(dǎo)致犢牛腹瀉。臨床癥狀表現(xiàn)為高熱,急性水樣腹瀉或出血性腹瀉,呈進(jìn)行性脫水,酸中毒癥狀,最終可衰竭死亡。隨著養(yǎng)牛業(yè)規(guī)模擴(kuò)大,犢牛腹瀉的病例呈上升趨勢,死亡率較高,成為影響犢牛早期的生長發(fā)育和后期生產(chǎn)性能的主要疾病之一。因此,弄清犢牛腹瀉病因,準(zhǔn)確做出診斷,及時(shí)治療,尤為重要。

大腸埃希菌(Escherichia coli)和沙門菌(Salmonella)是造成犢牛腹瀉的主要的細(xì)菌性病原微生物。在遺傳學(xué)上,大腸埃希菌有不同的種群,有些是典型非致病性的,是人類和動(dòng)物腸道正常微生物區(qū)系的一部分。然而,這種細(xì)菌的一些亞群獲得了致病基因,這使它們能夠引起腸內(nèi)和腸外疾病[1]。大量的研究表明,奶牛犢牛因大腸埃希菌病造成的死亡占其死亡總數(shù)的一半左右,而肉牛犢牛因大腸埃希菌病造成的死亡占其死亡總數(shù)的一半以上。產(chǎn)毒性大腸埃希菌(enterotoxigenicE.coli,ETEC)是引起犢牛腹瀉的常見主要病原菌[2],它分泌兩種腸毒素,即耐熱腸毒素(heat-stable toxin,ST)和不耐熱腸毒素(heat-labile toxin,LT)。ST與受體結(jié)合后,通過激活鳥苷酸環(huán)化酶,導(dǎo)致腹瀉;LT被宿主細(xì)胞內(nèi)吞后解體,解體產(chǎn)生的部分肽段可通過激活腺苷酸環(huán)化酶,導(dǎo)致腹瀉。從動(dòng)物體內(nèi)分離得到的ETEC的lt或st基因的序列有微小的差異,其致病性也有些差異[3]。A/E大腸埃希菌(attaching and effacingE.coli,AEEC)也被鑒定為犢牛痢疾及犢牛腹瀉的病原菌[4-5]。AEEC攜帶的eae基因編碼介導(dǎo)AEEC與腸上皮細(xì)胞緊密黏附的緊密素(Intimin)。Intimin介導(dǎo)的緊密黏附是A/E損傷的起始和必需步驟?？梢鸺膊〉划a(chǎn)生腸毒素的A/E大腸埃希菌被稱為致病性大腸埃希菌(entero-pathogenicE.coli,EPEC);既產(chǎn)生志賀毒素又有A/E效應(yīng),可以起出血性結(jié)腸炎(hemorrhagic colitis,HC)的A/E大腸埃希菌被稱為出血性大腸埃希菌(entero-hemorrhagicE.coli,EHEC)。沙門菌是僅次于大腸埃希菌的犢牛腸道病原菌,也是成年牛腹瀉的最重要的細(xì)菌性病原,主要侵害10日齡～30日齡犢牛[6],特別是都柏林沙門菌是犢牛腹瀉的主要病原菌。沙門菌的invA基因是其侵襲性基因[7],它在沙門菌A群～E群中高度保守。

為了更準(zhǔn)確及時(shí)地檢測犢牛細(xì)菌性腹瀉,了解犢牛細(xì)菌性腹瀉的病原學(xué)及流行病學(xué)概況,為臨床診斷與治療提供科學(xué)依據(jù),本試驗(yàn)以ETEC的st和lt、EPEC和EHEC的eae以及沙門菌的invA為靶基因,建立多重PCR檢測體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 大腸埃希菌C83922(O101:K99:F41,ST+)、C83923(O8 ∶K87,LT+ST+)、C83915(O9∶K103,9879:NM,ST+)、鼠傷寒沙門菌(C77-31,InvA+)購自中國獸藥監(jiān)察所;EHEC O157∶H7 EDL933(Stx1+,Stx2+,Intimin+)、豬鏈球菌2型458、都柏林沙門菌(InvA+)、大腸埃希菌重組菌株EWD299(LT+)、大腸埃希菌 DH5α、EHEC O157∶H7 86-24(Intimin+)、EPEC O127∶H6 E2348/69(Intimin+)由本實(shí)驗(yàn)室保存;其他的參考菌株為23株非ETEC、非AEEC大腸埃希菌、3株乳房鏈球菌、2株糞腸球菌的臨床分離株是由軍事獸醫(yī)研究所保存。

1.1.2 試劑和儀器 PCR儀(東勝創(chuàng)新 EDC-810);梅里埃 ViteK32自動(dòng)微生物鑒定儀;TaqDNA聚合酶為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;dNTP為北京鼎國生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒。

1.1.3 其他材料 麥康凱培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司,Balb/c小鼠購自長春生物制品研究所。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 以ETEC的st和lt基因、AEEC的eae基因以及致病性沙門菌的invA基因?yàn)樗闹豍CR的擴(kuò)增靶基因,分別根據(jù) GenBank上的M25607.1、M57244.1 和 CP001144.1,選取保守序列,使用Blast-Primer3設(shè)計(jì)st、lt和invA的引物(表1)。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.2.2 模板DNA制備 采用熱裂解法制備細(xì)菌的DNA模板。取200 μ L(參考菌株單菌落的培養(yǎng)液)或1 mL(待檢樣品的培養(yǎng)液)LB細(xì)菌培養(yǎng)液,12 000 r/min離心2 min,留菌體棄上清,加入 50 μ L的雙蒸水重懸沉淀,100 ℃水浴10min,10 000 r/min離心2 min沉淀菌體蛋白,取上清作為PCR的模板DNA;或從麥康凱培養(yǎng)基上挑取紫紅色(大腸埃希菌)或黃白(沙門菌)單菌落,用 50 μ L的雙蒸水重懸,將懸液100℃水浴10 min,10 000 r/min離心2 min沉淀菌體蛋白,取上清作為PCR的模板DNA;對于同步進(jìn)行平板計(jì)數(shù)的不同濃度梯度的菌液,取 200 μ L 100℃水浴 10 min,10 000 r/min離心2 min,離心沉淀菌體蛋白,取上清作為PCR模板。

表1 四重PCR的引物Table 1 Primers of multi-PCR

1.2.3 建立多重PCR反應(yīng)體系

1.2.3.1 不同退火溫度 Ta對多重PCR的影響梯度 PCR的 Ta為 12個(gè)梯度,分別為58℃,58.4℃,58.7℃,59.3℃,60.1℃,60.8℃,61.4℃,62.1℃,62.9℃,63.5℃,63.8℃,64℃。

1.2.3.2 不同引物濃度對多重PCR的影響 在梯度PCR中逐對增加PCR引物,每對引物的起始濃度為0.25 μ mol/L,試驗(yàn)中再上調(diào)或下調(diào)相應(yīng)引物的濃度,直至每條擴(kuò)增帶都達(dá)到較好的效果。

1.2.3.3 不同循環(huán)數(shù)對多重PCR的影響 多重PCR 分別進(jìn)行 26、27 、28、29、30、31 和 32 個(gè)循環(huán) 。

1.2.4 PCR特異性實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 參考菌株檢測 分別對 C83922、EDL933、都柏林沙門菌、EWD299 、C83923、C83915、C77-31、EHEC O157∶H7 86-24、EPEC O127∶H6 E2348/69,進(jìn)行四重PCR擴(kuò)增

1.2.4.2 對照菌株檢測 對23株非ETEC和非AEEC大腸埃希菌、3株乳房鏈球菌、2株糞腸球菌的臨床分離株進(jìn)行四重PCR擴(kuò)增。

1.2.4.3 PCR反應(yīng)特異性片段測序 瓊脂糖凝膠(20 g/L)電泳PCR產(chǎn)物,再使用DNA回收試劑盒回收,送寶生物工程(大連)有限公司測序。

1.2.5 PCR敏感性實(shí)驗(yàn) 挑取C83922、EDL933、都柏林沙門菌和EWD299的單菌落,接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中,37℃空氣振蕩培養(yǎng)12 h后,用生理鹽水10倍倍比稀釋,涂于麥康凱培養(yǎng)基上,平板計(jì)數(shù)。同時(shí)制作4種菌各個(gè)梯度的PCR模板。

1.2.6 臨床樣本檢測 從吉林省通化縣興林養(yǎng)牛場(T1-T5以及TX1、TX2)、通榆縣向海養(yǎng)牛場(X1-X5)、榆樹縣五棵樹養(yǎng)牛場(W1-W6)和乾安縣養(yǎng)牛戶(Q1-Q4)共采集到了22份腹瀉犢牛的糞便樣品。取2 g樣品,用1 mL生理鹽水漂洗,靜置10 min,取上清接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中,37℃空氣振蕩培養(yǎng)4 h。將1 mL菌液全部離心、重懸、水浴制備模板DNA,四重PCR檢測。

1.2.7 病原菌分離

1.2.7.1 生物過濾法分離病原菌 取2 g腹瀉犢牛的糞便樣品,用1 mL生理鹽水混懸,靜置10 min,取200 μ L洗液腹腔注射小鼠,待小鼠死后,取其心血?jiǎng)澗€接種于麥康凱平板。挑取單菌落重懸于50 μ L的雙蒸水,制備 PCR模板,多重 PCR檢測。

1.2.7.2 直接分離病原菌 取2 g腹瀉犢牛的糞便樣品,用1 mL生理鹽水混懸,靜置10 min,取100 μ L樣品重懸液,直接涂于麥康凱平板。挑取單菌落重懸于 50 μ L的雙蒸水,制備PCR模板,多重PCR檢測。

1.2.7.3 生化鑒定 選出PCR鑒定陽性的細(xì)菌菌株,用自動(dòng)微生物鑒定儀做生化鑒定。

2 結(jié)果

2.1 多重PCR的反應(yīng)體系和條件

2.1.1 不同退火溫度 Ta對多重PCR的影響 多重 PCR 在 Ta 為 58、58.4、58.7 、59.3、60.1、60.8、61.4℃時(shí),均能擴(kuò)增出4個(gè)靶基因。但是在Ta為60.8℃時(shí),效果最好。

2.1.2 不同引物濃度對多重PCR的影響 當(dāng)引物stF/R、invAF/R、eaeF/R和ltF/R的濃度依次為:0.4、0.3、0.2、0.2 μ mol/L 時(shí) ,多重 PCR 的擴(kuò)增效果最好。

2.1.3 不同循環(huán)數(shù)對多重PCR的影響 當(dāng)循環(huán)數(shù)為30時(shí),多重PCR效果最好

2.1.4 多重PCR最優(yōu)的反應(yīng)體系和條件 經(jīng)過條件優(yōu)化,四重PCR體系為:模板DNA,1 μ L;TaqDNA聚合酶2.5 U;10×PCR buffer(T ris-HCl pH 8.3 100 mmol/L;KCl 500mmol/L;MgCl2 15 mmol/L),2 μ L;每種 dNTP 濃度 250 μ mol/L;引物stF/R、invAF/R、eaeF/R和ltF/R的濃度依次為 :0.4 、0.3 、0.2 、0.2 μ mol/L;反應(yīng)體積20 μ L 。四重PCR反應(yīng)的最佳條件為:95℃預(yù)變性40 s;95℃30 s,60.8℃30 s,72℃1 min,30個(gè)循環(huán);最后延伸3 min。

2.2 多重PCR的特異性

2.2.1 參考菌株檢測 對 C83922、EDL933、都柏林沙門菌和EWD299混合模板進(jìn)行四重PCR(圖1),條帶特異、清晰。證明該四重PCR特異性強(qiáng)。

圖1 C83922、EDL933、都柏林沙門菌、EWD299以及混合模板的四重PCRFig.1 Identification of C83922,EDL933,Salmonella dublin,EWD299 and the admixture by the multi-PCR

四重 PCR 對 C83923、C83915、C77-31、EHECO157∶H7 86-24、EPEC O127∶H6 E2348/69的檢測結(jié)果與其已知的基因背景一致(表2)。

表2 實(shí)驗(yàn)室參考菌株的四重PCR檢測結(jié)果Table 2 Results of the multi-PCR to identify reference strains

2.2.2 對照菌株檢測 23株非ETEC和非AEEC大腸埃希菌、3株乳房鏈球菌、2株糞腸球菌的臨床分離株經(jīng)該四重PCR檢測均為陰性,證明該多重PCR特異性好。

2.2.3 多重PCR反應(yīng)特異性片段核酸序列 本試驗(yàn)所獲得st序列,較GenBank:M25607.1(note=“heat-stable enterotoxin I”)同源性為 97%;eae序列,較 GenBank:FJ609808.1(gene=“eae”product=“intimin”)同源性為96%;inv A序列 ,較Gen-Bank:CP001144.1(locus_tag=“SeD_A3206”product=“invasion protein InvA”)同源性為 99%;lt序列,較 GenBank:M57244.1(gene=“LT-A”product=“heat-labile enterotoxin subunit A”)同源性為97%。證明四重PCR特異、結(jié)果真實(shí)。

2.3 多重PCR的敏感性

通過平板計(jì)數(shù),確定多重 PCR反應(yīng)中對C83922、EDL933、都柏林沙門菌、EWD299 和它們混合菌液能過檢出的最小濃度分別為3×103、5×103、3×103、1×104、2×104cfu/mL 。試驗(yàn)證明該四重PCR敏感度高。

2.4 臨床樣本檢測

用該四重PCR檢測到22份臨床樣品中,T1、T2、T3、X2、X4、W1和 TX1 中含有eae;X1 和 X5中含有l(wèi)t;X4中還含有st(圖2)。

圖2 22份犢牛腹瀉樣品的四重PCR檢測結(jié)果Fig.2 Results of multi-PCR to identify 22 samples from diarrheal calves

2.5 病原菌分離

2.5.1 直接法和生物過濾法分離病原菌 通過直接分離和生物過濾法分離病原菌,得到相同的分離菌株 。在樣品 T1、T2、T3、X2、W1和 TX1中分離到攜帶eae基因的菌株;在樣品X1和X5中分離到攜帶lt的菌株;在樣品X4中分離到同時(shí)攜帶eae基因和st基因的菌株。

2.5.2 生化鑒定 用自動(dòng)微生物鑒定儀對分離到的菌株進(jìn)行生化鑒定,所測28項(xiàng)指標(biāo)均與大腸埃希菌生化指標(biāo)相符。

3 討論

ETEC在3種主要食用肉(牛肉、禽肉和豬肉)中的檢出相當(dāng)高[8],它分泌的兩種腸毒素ST和LT,其中ST對熱穩(wěn)定,其基因主要存在于質(zhì)粒上,少部分存在于轉(zhuǎn)座子上,是ETEC引發(fā)人畜腹瀉的主要毒力因子;LT對熱不穩(wěn)定,發(fā)現(xiàn)于人和動(dòng)物源性ETEC,與腹瀉有關(guān),編碼LT的基因都位于質(zhì)粒上。以st、lt為PCR擴(kuò)增靶序列,可以有效地檢測ETEC。選取EHEC和EPEC在eae上的同源序列為PCR擴(kuò)增靶序列,可以有效地同時(shí)鑒定兩種致病性的 AEEC。沙門菌的invA基因位于致病島-1(SPI-1),其所編碼的吸附和侵襲上皮細(xì)胞表面的InvA蛋白是Ⅲ型分泌系統(tǒng)不可缺失的組件,該蛋白決定沙門菌對腸黏膜細(xì)胞的侵襲力[9],invA基因發(fā)生變異的菌株不會引起腸道上皮細(xì)胞的病變,不少學(xué)者通過檢測該基因片段來顯示沙門菌的存在[10-12],選取高度保守的invA基因?yàn)镻CR擴(kuò)增靶序列,可有效的鑒定致病性沙門菌。

試驗(yàn)中的22份樣品中,有9份涉及到該四重PCR所選取的靶基因,這說明該四重PCR所選靶基因典型、具有很好的適用性。實(shí)驗(yàn)中分離到同時(shí)攜帶eae和st的大腸埃希菌,在犢牛腹瀉樣品中發(fā)現(xiàn)的這種新型大腸埃希菌的衍生及其與致病性的關(guān)系,有待進(jìn)一步的研究。在22份樣品中,沒有檢測到沙門菌,這可能與樣品采集都是在春末時(shí)節(jié)有關(guān),或許在這個(gè)時(shí)節(jié)中犢牛腹瀉的主要病原菌以大腸埃希菌為主。

傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、生化鑒定方法,費(fèi)時(shí)費(fèi)力,而且檢測率不高。單一PCR方法,一次只能檢測一種基因或一種病原菌,本實(shí)驗(yàn)中的四重PCR可同時(shí)檢測3種病原菌、4種毒力基因,迅速、高效。整個(gè)PCR檢測過程6 h左右,能夠及時(shí)地進(jìn)行犢牛腹瀉的臨床診斷。試驗(yàn)證明該四重PCR方法敏感性好、特異性高,具有可高通量檢測的特點(diǎn),可用于犢牛腹瀉的快速檢測。

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Multiplex PCR for Major Pathogenic Bacteria Causing Diarrhea in Calves

GAO Li-zhan1,LIU Jun1,ZHAO Xue-qian2,SUN Dong2,JIANG Li3,SUN Yang1,ZH U Ling-wei1,FENG Shu-zhang1

(1.Military Veterinary Institute,Academy of Military Medical Sciences,Changchun,Jilin,130062,China;2.Center for Animal Disease Control and Prevention,Tonghua County,J ilin,134100,China;3.Veterinary Research Institute of Jilin Prov ince,Changchun,Jilin,130062,China)

Abstrat:EnterotoxigenicEscherichia coli,attaching and effacingE.coli,andSalmonellaare major pathogenic bacteria causing diarrhea in calves.A multiplex PCR was developed to identify the bacteria by amplifying genes ofeaecarried by AEEC,invAcarried bySalmonella,standltcarried by ETEC.The multiplex PCR was verified by sequencing the products of PCR.The multiplex PCR was specific and sensitive and is efficient to detect the pathogenic bacteria.Nine of 22 clinical samples carrying related genes were detected by this multiplex PCR.

Escherichia coli;Salmonella;multiplex PCR

S854.43

A

1007-5038(2010)03-0030-05

2009-08-19

國家科技支撐計(jì)劃課題(2007BAB55B05)

高立戰(zhàn)(1985-),男,山東新泰人,碩士,主要從事分子細(xì)菌學(xué)研究。*通訊作者