李吉達,尹燕博*,徐守振,王建琳,王 光,劉興彩,韓麗敏,郭妍妍

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,山東青島 266109;2.青島澳蘭百特生物工程有限公司,山東青島 266101)

PRRSV的分離鑒定及與其他5種豬病毒混合感染情況調(diào)查

李吉達1,尹燕博1*,徐守振1,王建琳1,王 光1,劉興彩1,韓麗敏2,郭妍妍2

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,山東青島 266109;2.青島澳蘭百特生物工程有限公司,山東青島 266101)

應(yīng)用PCR檢測方法,對來自山東、河北、河南等10省44份表現(xiàn)高熱病癥狀的臨床發(fā)病豬病料,進行豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬圓環(huán)病毒(PCV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬巨細胞病病毒(PCMV)和豬流感病毒(SIV)6種病原的檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),6種病原中PRRSV的檢出率最高為72.7%;單純PRRSV感染的比例僅為2.27%。根據(jù)PCR檢測結(jié)果分析PRRSV與其他5種病毒的混合感染情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩重感染中PRRSV/PRV并發(fā)率最高(62.50%),三重感染中PRRSV/PRV/PCV并發(fā)率最高(43.75%),四重感染中PRRSV/PRV/PCV/PCMV并發(fā)率最高(28.125%),五重感染中PRRSV/PCV/PCMV/CSFV/PRV并發(fā)率最高(15.625%),PRRSV/PCV/PCMV/CSFV/PRV/SIV六重感染的比例為9.375%。將PRRSV陽性病料接種豬肺巨噬細胞和Marc-145細胞,共分離到9株P(guān)RRSV,分離率為28.1%。結(jié)果表明,發(fā)病豬多為感染PRRSV的同時混合感染其他多種病毒,為制定合理的免疫程序預(yù)防豬場各種疾病提供科學(xué)依據(jù)。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒;分離鑒定;混合感染

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)也稱豬藍耳病,最初于1987年首次報道于美國[1-2],其后在加拿大、德、法、荷蘭、英、西班牙、比利時、澳大利亞、日本、菲律賓等國家發(fā)生[3],并有全球蔓延趨勢。1992世界動物衛(wèi)生組織(OIE)在國際專家研討會上采用豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)這一名稱。1996年郭寶清等首次在暴發(fā)流產(chǎn)的胎兒中分離到豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV),證實了我國也有 PRRS的流行[4]。

2006年6月份開始,我國南方部分省市發(fā)生了以高熱不退、皮膚發(fā)紅、呼吸困難為主要臨床癥狀的豬高熱病疫情。中國動物疫病預(yù)防控制中心的田克恭博士最終確定本次高熱病是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株(NVDC～JXA1株)造成的,并定名為高致病性豬藍耳病,這次疫情的暴發(fā)給國內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[5-6]。2008年1月至2009年3月在對表現(xiàn)高熱病癥狀的臨床發(fā)病豬進行剖檢時發(fā)現(xiàn),許多病豬在表現(xiàn)間質(zhì)性肺炎、肺淤血實變等高熱病病變的同時,也表現(xiàn)大腸的扣狀潰瘍等豬瘟和其他病毒感染的病變,根據(jù)臨床癥狀初步診斷為PRRSV與其他多種病毒混合感染。本試驗對來自山東 、河北 、河南 、浙江 、湖南 、江 蘇 、上海 、江西 、福建、廣西10省市44份發(fā)病豬病料進行豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、豬圓環(huán)病毒(Porcine circo virus,PCV)、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、豬巨細胞病病毒(Porcine cytomegalo virus,PCMV)、豬流感病毒(Swine influenza virus,SIV)6種病毒的檢測,擬對PRRS與以上其他5種病毒的混合感染情況進行研究,為豬病的綜合防控提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2008年1月到2009年3月,來自山東 、河北 、河南 、浙江 、湖南 、江蘇 、上海 、江西 、福建 、廣西10省臨床發(fā)病豬病料。

1.1.2 細胞與毒株 原代豬肺泡巨噬細胞(porcine alveolar macrophages,PAM)由本實驗室制備;Marc-145細胞由本實驗室凍存;PRRSV毒株JXA1株,購自中國動物疫病預(yù)防控制中心。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計PCR引物,參照序列VR-2332設(shè)計針對PRRSV N蛋白基因 檢 測 引 物 PRRSV1:5′-GCCCCTGCCCACCACgG-3′PRRSV2:5′-TCGCCCTAAT TGAATAGGT-3′;參照序列 J04358.2設(shè)計針對 CSFV 多聚蛋白基因檢測引物CSFV1:5′-GCTCCTGGTTGGTAACCTCGG-3′CSFV2:5′-TGATGCTGTCACACAGGTGAA-3′;參照序列 DQ017036 設(shè)計針對PCV-2型 Rep蛋白基因檢測引物 PCV1:5′-TTATTGTTGGCGAGGAGGGTA-3PCV2:5′-CCATCCCACCACTTGTT TCTA-3;參照序列AF207700設(shè)計針對PRV gE基因檢測引物PRV1:5′-TACGTCACGGTCATCAAGG-3 PRV2:5′-CATATGTGGGTCCAT TCGTC-3′;參 照 序 列AF394056設(shè)計針對PCMV gB基因檢測引物PCMV1:5′-ATGACAGTGAGCAGTCGGAA-3 PCMV2:5′-TCACACGTCCTCGGTGGATAG-3′;參照序列CY022955設(shè)計針對SIV M蛋白基因檢測引 物 SIV1:5′-CAAGACCAATCCTGTCAATC-3′SIV2:5′-GCCTCTGCCTGTTCACT-3′。

1.2.2 PRRS與其他5種病毒病混合感染情況調(diào)查

1.2.2.1 組織樣品的處理 稱取病料組織10 g于組織勻漿機中,加入生理鹽水100 mL研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)移至鹽水瓶內(nèi)反復(fù)凍融3次,置-20℃凍存。

1.2.2.2 組織樣品的RT-PCR檢測 取凍融好的組織勻漿液,用酸性酚-硫氰酸胍-氯仿法提取病毒RNA,通過一步法RT-PCR試劑盒對豬病料進行各種病毒的檢測。

1.2.2.3 檢測結(jié)果的統(tǒng)計分析 根據(jù)PCR檢測結(jié)果,比較6種病毒的檢出率;PCR檢測PRRSV陽性病料中,分別統(tǒng)計PRRS與其他5種病毒病二重感染、三重感染、四重感染、五重感染以及六重感染的比例。

1.2.3 病毒分離鑒定

1.2.3.1 PAM細胞的制備 將50日齡的無特定病原(specific pathogen free,SPF)仔豬放血,結(jié)扎氣管后無菌摘取肺臟,先用9 g/L的生理鹽水洗滌外表面,將pH7.4的PBS 50 mL從氣管灌入肺臟,輕輕拍打肺表面,5 min后回收灌洗液,如此反復(fù)進行,直至共回收約200 mL。將回收的支氣管肺泡灌洗液用吸管輕輕吹打,將細胞團塊打散,用單層無菌100目不銹鋼篩過濾,收集全部灌洗液,1 500 r/min離心10 min,留沉淀;用無菌的PBS(pH 7.4)重懸細胞,1 500 r/min離心10 min,留沉淀;同上方法重復(fù)1次;含100 mL/L胎牛血清的1×RPMI1640營養(yǎng)液重懸細胞,置細胞瓶,在37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h。棄上清,用含20 mL/L胎牛血清的1×RPMI1640營養(yǎng)液洗滌2次,除去非黏附細胞繼續(xù)用含100 mL/L胎牛血清的1×RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)備用。

1.2.3.2 病毒的分離 取RT-PCR檢測PRRSV陽性的肺組織勻漿,3 000 r/min離心15 min,取上清經(jīng)0.22 μ m微孔濾膜進行過濾除菌。按10%的比例接種長成單層的PAM細胞和Marc-145細胞,37℃CO2培養(yǎng)箱內(nèi)吸附1 h后倒掉毒液,加入含20 mL/L小牛血清的細胞維持液,37℃CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d后收細胞及細胞液,置-20℃凍存。將上一代的細胞及細胞液反復(fù)凍融2次以后接種下一代長成單層的PAM細胞和Marc-145細胞,如此盲傳直至出現(xiàn)典型的細胞病變,收獲細胞毒。

1.2.3.3 分離株的RT-PCR鑒定 收獲的細胞毒反復(fù)凍融2次以后,用酸性酚-硫氰酸胍-氯仿法提取病毒 RNA,通過一步法 RT-PCR試劑盒進行PRRSV分離株鑒定。核酸提取時設(shè)正常的Marc-145細胞為陰性對照,JXAI株為陽性對照。

2 結(jié)果

2.1 PRRSV與其他5種病毒檢測結(jié)果

自2008年1月-2009年3月對來自山東、河北 、河南、浙江 、湖南、江蘇 、上海 、江西 、福建 、廣西10省市的44份豬病料分別進行PRRSV、CSFV、PCV、PRV、PCMV和SIV的6種疾病檢測,結(jié)果見表1。

2.2 PRRSV與其他5種病毒混合感染情況統(tǒng)計

2.2.1 各種病毒檢出率對比觀察 根據(jù)表1所列檢測結(jié)果,統(tǒng)計所檢測病料中各種病毒的檢出率,對比觀察各種病毒檢出率的高低(圖1)。陽性率分別為 PRRSV 72.7%、PCV 59.1%、SIV 54.5%、PRV 52.3%、CSFV 50.0%、PCMV 45.5%。統(tǒng)計顯示,2008年以來豬病以PRRS的發(fā)病率最高。

2.2.2 PRRSV與另外一種病毒二重感染情況分析 根據(jù)表1所列檢測結(jié)果,PRRS陽性結(jié)果中,統(tǒng)計其他一種病毒與PRRSV同時感染的概率(圖2)。PRRSV/PRV的并發(fā)率為62.5%;PRRSV/PCV的并發(fā)率為59.4%;PRRSV/SIV的并發(fā)率為53.1%;PRRSV/CSFV的并發(fā)率為50.0%;PRRSV/PCMV的并發(fā)率為50.0%。PRRSV與一種病毒混合感染情況統(tǒng)計比較顯示,PRRSV/PRV的并發(fā)率最高,這與臨床中發(fā)病豬大都出現(xiàn)神經(jīng)癥狀密切相關(guān),而與其他病毒的并發(fā)率也都在50%以上,單純的PRRS發(fā)病率僅有2.27%。

表1 RT-PCR檢測結(jié)果Table 1 Result of RT-PCR dection

(續(xù)表)

圖1 不同病毒的檢出率 Fig.1 Detection rates of different viruses

圖2 PRRSV與另外一種病毒二重感染情況Fig.2 Dual infection of PRRSV and another virus

2.2.3 PRRSV與另外兩種病毒三重感染情況分析

根據(jù)表1所列檢測結(jié)果,PRRS陽性結(jié)果中,統(tǒng)計其他兩種病毒與 PRRS同時感染的概率,對比觀察PRRSV與其他兩種病毒的混合感染情況(圖3)。PRRSV/PRV/PCV的并發(fā)率為43.75%;PRRSV/CSFV/SIV的并發(fā)率為37.5%;PRRSV/PRV/PCMV的并發(fā)率為34.375%;PRRSV/CSFV/PRV的并發(fā)率為31.25%;PRRSV/CSFV/PCMV的并發(fā)率為31.25%;PRRSV/PRV/SIV的并發(fā)率為31.25%;PRRSV/PCMV/SIV的并發(fā)率為28.125%;PRRSV/PCMV/PCV的并發(fā)率為28.125%;PRRSV/PCV/SIV的并發(fā)率為28.125%;PRRSV/CSFV/PCV的并發(fā)率為25%。PRRSV與兩種病毒混合感染情況統(tǒng)計顯示:PRRSV/PRV/PCV的并發(fā)率最高。

圖3 PRRSV與另外兩種病毒三重感染情況Fig.3 Triple infection of PRRSV and the other two viruses

2.2.4 PRRSV與另外3種病毒四重感染情況分析 根據(jù)表1所列檢測結(jié)果,PRRS病毒陽性結(jié)果中,統(tǒng)計其他3種病毒與PRRSV同時感染的概率,對比觀察PRRSV與其他 3種病毒的混合感染情況(圖4)。PRRSV/PRV/PCV/PCMV的并發(fā)率為28.125%;PRRSV/PCV/SIV/PRV的并發(fā)率為21.875%;PRRSV/CSFV/PCV/PRV的并發(fā)率為18.75%;PRRSV/PCMV/SIV/PRV的并發(fā)率為18.75%;PRRSV/PCV/SIV/CSFV的并發(fā)率為15.625%;PRRSV/PCV/PCMV/CSVF的并發(fā)率為15.625%。PRRSV與3種病毒混合感染情況統(tǒng)計比較顯示,PRRSV/PRV/PCV/PCMV的并發(fā)率最高。

圖4 PRRS與另外3種病毒四重感染情況Fig.4 Mixed infection of PRRSV and the other three viruses

2.2.5 PRRS與另外4種病毒五重感染情況分析 根據(jù)表1所列檢測結(jié)果,PRRSV陽性結(jié)果中,統(tǒng)計其他4種病毒與PRRS同時感染的概率,對比觀察PRRS與其他4種病毒的混合感染情況(圖5)。PRRSV/PCV/PCMV/CSFV/PRV的并發(fā)率為15.625%;PRRSV/PCV/PCMV/SIV/PRV的并發(fā)率為12.5%;PRRS/PC/PCM/SI/CSF的并發(fā)率為9.375%;PRRSV/PCV/PCMV/PRV/CSFV的并發(fā)率為9.375%。PRRSV與4種病毒混合感染情況統(tǒng)計顯示,PRRSV/PCV/PCMV/CSFV/PRV的并發(fā)率最高。

圖5 PRRSV與另外4種病毒五重感染情況比較Fig.5 Mixed infection of PRRSV and the other four viruses

2.2.6 PRRSV與另外5種病毒的六重感染情況分析 結(jié)果顯示PRRSV/PCV/PCMV/CSFV/PRV/SIV并發(fā)率為9.375%。

2.3 病毒分離鑒定結(jié)果

2.3.1 PRRSV在細胞上的增殖 長成單層的PAM細胞在接種PRRSV陽性病料72 h后,細胞出現(xiàn)聚堆、脫落等典型的病變;長成單層的Marc-145細胞接種PRRSV陽性病料后,盲傳至第3代時開始出現(xiàn)聚堆、拉網(wǎng)、脫落等典型的細胞病變。

2.3.2 分離株RT-PCR鑒定結(jié)果 經(jīng)RT-PCR鑒定,共分離出9株P(guān)RRSV,圖6所示為分離株RTPCR鑒定后的電泳結(jié)果。根據(jù)豬病料的采集時間及來源對9株P(guān)RRSV分別進行命名(表2)。

圖6 RT-PCR分離株檢測結(jié)果Fig.6 Detection result of isolated strains by RT-PCR

表2 分離的9株P(guān)RRSVTable 2 9 PRRSV isolated strains

3 討論

自2006年7月以來,先后在我國河北、湖北、浙江、江西、安徽、山東等地出現(xiàn)了以育肥豬和架子豬體溫升高(39.5℃～41.8℃),高熱不退,臥地不食,體表皮膚發(fā)紅,運動不協(xié)調(diào)等主要臨床癥狀的一種急性傳染病。由于該病病因復(fù)雜,且為多病原混合感染,故統(tǒng)稱為“豬無名高熱綜合征”[7]。2007年Tian K等[5]的試驗表明,2006年豬“高熱病”是由PRRSV變異株(JXA1株)引起的,業(yè)內(nèi)公認該毒株是高致病性豬藍耳病病毒。本次研究對來自全國10省市的44份表現(xiàn)高熱病癥狀的臨床發(fā)病豬進行了6種病毒病的檢測,統(tǒng)計檢測結(jié)果,44份被檢測病料中有32份PRRSV陽性,檢出率高達72.7%,PRRSV無疑是造成高熱病的主要病因。在后續(xù)的研究中(尚未發(fā)表),通過測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離到的 PRRSV均為變異株,且與高致病性毒株JXA1株高度同源。在SPF動物房對PRRSV抗原抗體雙陰性豬進行的免疫保護試驗中,針對PRRSV變異株的疫苗對高致病性豬藍耳病的發(fā)生起到了有效地預(yù)防作用。

然而,據(jù)養(yǎng)殖戶及臨床獸醫(yī)反映,針對PRRSV變異株的疫苗在臨床應(yīng)用中效果并不是很好,仍有豬死于高熱病。我們在對臨床發(fā)病豬進行觀察及剖檢時發(fā)現(xiàn),多數(shù)的臨床發(fā)病豬有神經(jīng)癥狀,剖檢時病死豬大腸的扣狀潰瘍、腎臟的出血、脾臟邊緣出血性梗死等豬瘟特征性病變和其他病毒病的病變非常普遍,根據(jù)臨床病變我們初步診斷為PRRSV與其他多種病毒(尤其是豬瘟病毒)混合感染。PRRSV主要在單核巨噬細胞內(nèi)復(fù)制,尤其是肺泡巨噬細胞,然后進一步擴散到全身多處組織的巨噬細胞和單核細胞,使豬的免疫力降低,從而產(chǎn)生免疫抑制,促使其他多種病毒感染的發(fā)生,從而引起混合感染,并最終導(dǎo)致豬的死亡[8]。顯然,單純接種PRRS疫苗對于潛在多種病原的豬場不會起到有效的防控作用。我們的研究結(jié)果證實,在所檢測的 6種病毒中,PRRSV的發(fā)生率最高(72.7%)。PRRSV與一種疾病混合感染情況統(tǒng)計顯示,在所檢測的5種病毒中,PRV/PRRSV的并發(fā)率最高(62.5%),PRRS與其他4種病毒并發(fā)的比例均在50%以上。本次研究中,針對6種病毒的檢測并沒有進行野毒株和疫苗株的區(qū)分,因此檢測結(jié)果中不排除有疫苗株。

PRRSV高達70%以上的檢出率提示我們,PRRS是當(dāng)前危害養(yǎng)豬場的主要疾病之一,PRRS的防控刻不容緩。本研究分別統(tǒng)計了PRRSV與其他2種～5種病毒并發(fā)感染的情況。結(jié)果表明,絕大多數(shù)情況下PRRSV與多種病毒混合感染引起豬發(fā)病,單純的PRRSV發(fā)生幾率很小,僅為2.27%,可見豬場疫病防控應(yīng)以綜合防控為主。針對PRRSV及其他多種病毒制定科學(xué)的免疫程序,以及必要的生物安全措施,是決定綜合防控成敗的關(guān)鍵所在。目前豬場疫病的防控難度越來越大,引進陰性種豬,對豬場進行各種疫病的凈化刻不容緩。

用于PRRSV分離和體外培養(yǎng)的細胞主要有豬肺泡巨噬細胞[6]、非洲綠猴腎細胞傳代細胞系Marc-145細胞[9],以及CL2621細胞等。本次研究中采用了豬肺泡巨噬細胞(PAM)和Marc-145細胞兩種細胞進行病毒分離。有研究表明 PRRSV更易在PAM 細胞中生長[10-11],本研究發(fā)現(xiàn),相比較而言,毒株在PAM細胞上有良好的適應(yīng)性,病毒在Marc-145細胞上的適應(yīng)時間更長。本次試驗中共分離到9株P(guān)RRSV,分離率為28.1%。分離病毒時我們發(fā)現(xiàn)并非所有的陽性病料中都能夠分離到病毒,這可能與病料中活毒的含量以及不同毒株在細胞上適應(yīng)性不同有關(guān)。

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Isolation and Identification of PRRSV and Investigation of Mixed Infection between PRRSV and Other Five Viruses

LI Ji-da1,YIN Yan-bo1,XU Shou-zhen1,WANG Jian-lin1,WANG Guang1,LIU Xing-cai1,HAN Li-min2,GUO Yan-yan2

(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine,Qingdao Agricultural University,Qingdao,Shandong,266109,China;2.QingdaoOland-Better Bioengineering CO.L TD,Qingdao,Shandong,266101,China)

The PRRSV,CSFV,PCV,PRV,PCMV and SIV were detected by PCR from 44 clinical samples from ten provinces including Shandong,Hebei,and Henan etc,and the mixed infection information among PRRSV and CSFV,PCV,PRV,PCMV,SIV were analysed.The results showed that the incidence of PRRSV was highest in these six viruses and its detection rate was up to 72.7%,single infection rate of PRRSV was only 2.27%.The mixed infection information analysis among PRRSV and other viruses indicated that PRRSV/PRV was highest in the co-infection of PRRS with another viruses and its detection rate was up to 62.50%,PRRSV/PRV/PCV was highest in the co-infection of PRRS with other two viruses and its detection rate was up to 43.75%,PRRSV/PRV/PCV/PCMV was highest in the co-infection of PRRSV with other three viruses and its detection rate was up to 28.125%,PRRSV/PCV/PCMV/CSFV/PRV was highest in the co-infection of PRRSV with other four viruses and its detection rate was up to 15.625%,and PRRSV/PCV/PCMV/CSFV/PRV/SIV was up to 9.375%.Nine PRRSV strains were isolated by inoculating the PAM and MARC-145 cells from positive samples and isolating rate was upto 28.1%.The results demonstrated that the clinical cases were co-infected with PRRSV and other viruses mostly,which provided scientific basis for formulating the reasonable immune program to prevent all kinds of diseases in the swine farm.

PRRSV;isolation and identification;mixed infection

S852.659.6;S858.28

A

1007-5038(2010)03-0048-07

2009-10-13

李吉達(1984-),男,山東鄒平人,碩士,主要從事分子流行病學(xué)研究。*通訊作者