王愛萍,占松鶴,朱良強(qiáng)*,祁克宗,姚雪靜

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,安徽合肥 230036;2.安徽省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心,安徽合肥 230036)

三種藥物對(duì)PRRSV的體外抑制試驗(yàn)*

王愛萍1,占松鶴2,朱良強(qiáng)2*,祁克宗1,姚雪靜1

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,安徽合肥 230036;2.安徽省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心,安徽合肥 230036)

選取干擾素、黃芪多糖、利巴韋林作為抗病毒藥物,利用MTT法與細(xì)胞病變(CPE)抑制試驗(yàn),通過PRRSV感染Marc-145細(xì)胞、病毒在細(xì)胞中復(fù)制、藥物直接和病毒作用三個(gè)環(huán)節(jié),對(duì)藥物的作用效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示,3種藥物體外對(duì)PRRSV的都具有抑制作用,干擾素、黃芪多糖體外對(duì)PRRSV具有明顯的阻斷作用,利巴韋林體外對(duì)PRRSV具有殺滅作用。因此,這3種藥物在細(xì)胞水平上均有抑制病毒的作用,為防控PRRS提供了理論依據(jù)。

干擾素;黃芪多糖;利巴韋林;豬繁殖與呼吸綜合征

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiration syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種急性接觸性傳染病,主要引起妊娠母豬的繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀[1-2]。1996年,郭寶清在國(guó)內(nèi)首次分離到PRRSV,目前該病在我國(guó)廣泛存在,已成為危害養(yǎng)豬業(yè)的重要病毒性疾病之一[3-4]。目前對(duì)該病的防控主要是采用接種疫苗的方法。但由于PRRSV存在高度的變異性,有時(shí)一個(gè)豬場(chǎng)同時(shí)存在兩種不同的病毒變異株,給該病的免疫與防控帶來(lái)了一系列的問題。又由于參與PRRS免疫保護(hù)的不僅有體液免疫,還有細(xì)胞免疫,因此用滅活疫苗免疫防制PRRS效果不佳,弱毒疫苗可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生全面的免疫應(yīng)答,提高了針對(duì)PRRSV的免疫保護(hù)水平,但用弱毒疫苗存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn),這一點(diǎn)已在幾年前丹麥等國(guó)因廣泛使用弱毒苗而導(dǎo)致該病大暴發(fā)中得以證實(shí)。因此,抗病毒藥物則成為緊急預(yù)防和治療該病的主要手段之一。

利巴韋林、干擾素、黃芪多糖是臨床上常用的抗病毒藥物。黃芪多糖能促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生抗病毒干擾素,抑制病毒蛋白的合成,從而使機(jī)體產(chǎn)生抗病毒感染作用[5-6]。而干擾素具有廣譜抗病毒活性,且具有速效多能的特點(diǎn)[7]。利巴韋林為臨床上常用的廣譜抗病毒藥物。本試驗(yàn)選取這3種藥物,以安徽部分地區(qū)發(fā)病豬體內(nèi)分離到的PRRSV為受試病毒,觀察藥物對(duì)該病毒的體外抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 黃芪多糖(105μ g/mL)由本實(shí)驗(yàn)室配制;利巴韋林(105μ g/mL),江蘇漣水制藥有限公司產(chǎn)品,生產(chǎn)批號(hào):0812162;豬基因工程干擾素(106IU/mL),大連三儀動(dòng)物藥品公司產(chǎn)品,生產(chǎn)批號(hào):08082502。

1.1.2 病毒與細(xì)胞 PRRSV、Marc-145細(xì)胞由安徽省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心提供。

1.1.3 主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品,胎牛血清為杭州四季青工程有限公司產(chǎn)品,胰蛋白酶為AM2RESCO公司產(chǎn)品,EDTA為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品,青霉素(80萬(wàn)單位)、鏈霉素(80萬(wàn)單位)為華北制藥有限公司產(chǎn)品,噻唑藍(lán)、二甲基亞砜(DMSO)為上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品,CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱為Kendro儀器公司產(chǎn)品,2級(jí)生物安全柜為ESCO科技有限公司產(chǎn)品,倒置顯微鏡為日本尼康公司產(chǎn)品,酶標(biāo)儀為TECAN公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 黃芪多糖的提取 將黃芪根(粉末)加入到5倍～8倍量蒸餾水中,在68℃下浸取3 h,過濾得提取液。將提取液冷至室溫后,傾入2倍體積的950 mL/L酒精,離心分離,得到黃芪多糖,再用950 mL/L酒精洗滌,然后干燥;將干燥物溶于10倍量的蒸餾水中,加熱到100℃,保持5 min～8 min,冷卻后,過濾除去沉淀,用AB-8吸附樹脂對(duì)濾液脫色,得透明液體,然后重復(fù)上述醇沉過程,得到純化的黃芪多糖。然后取黃芪多糖0.1 g,溶于1 mL細(xì)胞維持液中,過濾除菌,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PRRSV毒力的測(cè)定 常規(guī)方法消化Marc-145細(xì)胞[8],用生長(zhǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)成1×106個(gè)/mL,接種到 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,100 μ L/孔,在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)形成細(xì)胞單層,接種稀釋度分別為10-1～10-10的病毒液,每個(gè)稀釋度8孔,100 μ L/孔,同時(shí)設(shè)不加病毒的正常細(xì)胞對(duì)照,連續(xù)觀察7 d記錄細(xì)胞病變。按照Reed-Muench法計(jì)算 TCID50。

1.2.3 藥物的毒性測(cè)定 在96孔培養(yǎng)板上進(jìn)行,用維持液將藥物作連續(xù)2倍稀釋,分別接種到長(zhǎng)成良好的單層細(xì)胞中,每個(gè)稀釋濃度接種5孔,同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。在37℃體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)120 h,每日觀察CPE情況。3種藥物的稀釋濃度見表1。

表1 干擾素、黃芪多糖、利巴韋林稀釋濃度Table 1 Diluted concentrations of IFN,ASP,RBV

1.2.4 藥物對(duì) PRRSV的抑制作用測(cè)定 將100TCID50病毒液接種至長(zhǎng)成單層Marc-145的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上,0.1 mL/孔,37℃吸附1 h,棄去病毒液,用 PBS洗 2遍,加入倍比稀釋的藥物,0.1 mL/孔,每個(gè)稀釋度重復(fù)5孔。在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天觀察CPE,72 h測(cè)定 Marc-145細(xì)胞活力。同時(shí)制定CPE判定標(biāo)準(zhǔn):記錄“-”為正常細(xì)胞,“+”為25%以上的細(xì)胞出現(xiàn)CPE,“++”為 50%以上的細(xì)胞出現(xiàn) CPE?！?++”為75%以上細(xì)胞出現(xiàn)CPE。

1.2.5 藥物在Marc-145細(xì)胞上對(duì)PRRSV的阻斷作用測(cè)定 以不同濃度的藥液加入細(xì)胞層,于37℃培養(yǎng)4 h,然后棄去藥液,用PBS洗2遍,每孔接種100TCID50病毒液0.1 mL/孔,在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),記錄方法和測(cè)定方法同上。

1.2.6 藥物對(duì)PRRSV的直接殺滅作用測(cè)定 將不同稀釋度的藥液分別與等體積100TCID50病毒液混合,37℃作用2 h,加至長(zhǎng)成單層Marc-145的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上,0.1 mL/孔,每個(gè)稀釋度重復(fù)5孔。在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),記錄方法和測(cè)定方法同上。

以上試驗(yàn)均在藥物的最大無(wú)毒濃度下進(jìn)行,并設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照組,病毒感染對(duì)照組,按常規(guī)條件培養(yǎng)。

1.2.7 Marc-145 細(xì)胞活力測(cè)定 應(yīng)用MT T比色法細(xì)胞增殖定量檢測(cè)細(xì)胞活力。先加入 10 μ L MTT溶液,2 h后棄掉溶液,然后每孔加入100 μ L DMSO溶解結(jié)晶,15 min后置微孔板振蕩器上振蕩;最后在酶標(biāo)儀上測(cè)定570 nm波長(zhǎng)處的OD值,并作為細(xì)胞活性指標(biāo);采用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,比較藥物各劑量組的OD值與病毒對(duì)照組OD值之間的差別以評(píng)價(jià)藥物的抗病毒作用。

2 結(jié)果

2.1 PRRSV在Marc-145細(xì)胞上的毒力測(cè)定結(jié)果

Marc-145傳代細(xì)胞加入96孔板,24 h后可長(zhǎng)成致密的單層,正常細(xì)胞呈三角形、多角形、等多種形態(tài),細(xì)胞輪廓清晰。接種PRRSV 72 h～96 h后,細(xì)胞多角形輪廓逐漸失去棱角,細(xì)胞脫落、變圓、團(tuán)縮、聚集成堆。按 Reed-muench法計(jì)算距離比得出PRRSV TCID50結(jié)果為106.25TCID50/mL。

2.2 藥物毒性測(cè)定結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果顯示,干擾素對(duì)Marc-145細(xì)胞最大無(wú)毒濃度為6.25×104U/mL,黃芪多糖和利巴韋林分別為1.25×103μ g/mL 和3.12×103μ g/mL。

2.3 藥物對(duì)PRRSV的抑制作用的測(cè)定結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明,干擾素、黃芪多糖、利巴韋林對(duì)PRRSV在Marc-145細(xì)胞上的增殖具有明顯的抑制作用,3種藥物分別在0.39×104U/mL、1.56×103μ g/mL、0.39×103μ g/mL濃度時(shí)具有極顯著的抑制CPE作用(P＜0.01),其中干擾素對(duì)PRRSV引起的CPE最小抑制濃度為0.2×103U/mL,利巴韋林的最小抑制濃度為 0.2×103μ g/mL(表2)。

表2 IFN、APS、RBV在Marc-145細(xì)胞上對(duì)PRRSV的抑制作用結(jié)果Table 2 The inhibitory activity of IFN,ASP and RBV on M arc-145 infected with PRRSV

2.4 藥物在Marc-145細(xì)胞上對(duì)PRRSV的阻斷作用

由表3可知,干擾素、黃芪多糖分別在0.39×104U/mL、1.56×103μ g/mL 時(shí)阻止病毒侵入的作用極顯著(P＜0.01)。利巴韋林在3.125、1.56×103μ g/mL時(shí) OD值顯著大于病毒對(duì)照組(P＜0.05),其他濃度差異不顯著。

表3 IFN、APS、RBV在Marc-145細(xì)胞對(duì)PRRSV的阻斷作用結(jié)果Table 3 The blocking activity of IFN,APS and RBV on Marc-145 infected with by PRRSV

2.5 藥物對(duì)PRRSV的直接殺滅作用

由表4可以看出,干擾素、利巴韋林分別在0.78×103U/mL、0.39×103μ g/mL時(shí)OD 值均極顯著大于病毒對(duì)照組(P＜0.01)。黃芪多糖在12.5×103μ g/mL較高濃度時(shí),OD值顯著大于病毒對(duì)照組(P＜0.05),其他濃度對(duì)病毒直接殺滅作用不顯著。

3 討論

關(guān)于藥物抗病毒作用的機(jī)理,一般認(rèn)為是多途徑的,但主要有兩條途徑,一是抑制病毒的繁殖,二是直接殺滅病毒。本試驗(yàn)按不同的給藥途徑設(shè)計(jì)了3組試驗(yàn),第1組先接種病毒后加藥物,目的是觀察藥物能否對(duì)細(xì)胞內(nèi)的病毒起作用,抑制其生物合成及成熟釋放;第2組先加藥物后接種病毒,目的是觀察藥物能否進(jìn)入細(xì)胞或吸附細(xì)胞表面以阻止病毒的吸附和進(jìn)入;第3組藥物和病毒感作后同時(shí)加入,目的是觀察藥物對(duì)病毒的直接殺滅作用[9]。

試驗(yàn)測(cè)定了最大安全濃度范圍內(nèi)的3種藥物對(duì)PRRSV的敏感性。結(jié)果顯示病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制時(shí),黃芪多糖、干擾素、利巴韋林分別有4、5、4個(gè)濃度的藥物組OD值極顯著大于病毒對(duì)照組(P＜0.01),表明這3種藥物有較強(qiáng)的抑制病毒復(fù)制作用。病毒在PRRSV侵入 Marc-145細(xì)胞時(shí),結(jié)果顯示干擾素、黃芪多糖分別有5、4個(gè)濃度的藥物組OD值極顯著大于病毒對(duì)照組(P＜0.01),表明這2種藥物有較強(qiáng)的抗病毒侵入細(xì)胞的作用。干擾素、利巴韋林分別在4、4個(gè)梯度是藥物組的OD值極顯著大于病毒組OD值,說(shuō)明這兩種藥物對(duì)病毒直接殺滅作用明顯。且各種藥物的抗病毒效果均呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系,藥物必須有合適的劑量才能發(fā)揮最佳藥效。在進(jìn)行藥物體外抗病毒的研究過程中,最為常用的方法是CPE法[10]。在顯微鏡下觀察病毒引起的細(xì)胞病變,但此法主觀性強(qiáng),且不能進(jìn)行精確的定量分析。MT T分析法是使用MT T[(4,52二甲基噻唑)2,52二苯基四唑溴化物]對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色,通過檢測(cè)其光密度(OD值)的改變可判斷細(xì)胞的活性,了解藥物作用,從而進(jìn)行藥效的定量分析。邵文愛等[11]對(duì)MT T法和CPE法進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)用

表4 IFN、APS、RBV對(duì)PRRSV的直接殺滅作用結(jié)果Table 4 The direct killing activity of the IFN,APS and RBV on P RRSVin vitro

CPE法判斷細(xì)胞完全病變的稀釋度,用MT T法卻測(cè)定出還有細(xì)胞成活,證明MT T法能較敏感的檢測(cè)出輕微的細(xì)胞病變,是一種快速客觀準(zhǔn)確的篩選和評(píng)價(jià)抗病毒藥物的方法。MT T法與CPE法相結(jié)合可定量、精確地評(píng)估藥物抗病毒的活性。

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Inhibitive Effects of APS,RBV and IFN on PRRSVin vitro

WANGA Ai-ping1,ZHAN Song-he2,ZH U Liang-qiang1,QI Ke-zong1,YAO Xue-jing1

(1.College of Animal Science and Technology,Anhui Agricultural University,He fei,Anhui,230036,China;2.Anhui Animal Epidemic Disease Prevention and Control Center,He fei,Anhui,230036,China)

APS,RBV and IFN were adopted as antiviral drugs to evaluate the inhibitive effects to porcine respiratoryand reproductive syndrome virus(PRRSV)in vitroby the MT T and CPE assay through virus invading and replicating in Mark-145 cells,and the effect of direct inactiving virus.The results indicated that the three drugs had obviously inhibitive effect on the virusin vitro.IFN,APS had obviously blocking effect on PRRSVin vitro;RBV had obvious direct killing virus role.So IFN,APS and RBV could inhibit the replication of virus at cell level.This can provid seientific theory for PRRS control.

interferon(IFN);Astragaluspolysaccharide(ASP);ribavirin(RBV);PRRSV

S852.659.6;S859.7

A

1007-5038(2010)03-0060-04

2009-09-27

安徽省科技攻關(guān)項(xiàng)目(08010302150)

王愛萍(1983-),女,山東單縣人,碩士研究生,主要從事動(dòng)物疫病生物防控研究。*通訊作者