張 燕,王洪斌,范宏剛,盧德章

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱150030)

乙酰膽堿(ACh)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),與自主神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、肌肉運(yùn)動(dòng)、大腦意識(shí)與思維、學(xué)習(xí)與記憶等都有廣泛聯(lián)系,對(duì)激活并維持腦電和行為的覺醒有重要作用。大量的動(dòng)物研究表明,抑制ACh在中樞的釋放和傳遞是全麻藥產(chǎn)生中樞麻醉作用的機(jī)制之一[1-4]。

噻環(huán)乙胺(鹽酸乙胺噻酚環(huán)己酮,tiletamine hydrochloride),又名替來他明,為苯環(huán)己哌啶類靜脈全麻藥。近年來噻環(huán)乙胺逐漸被引入到國內(nèi)動(dòng)物臨床麻醉中,但是由于其中樞作用機(jī)制不是很清楚,影響了其在國內(nèi)動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的深度開發(fā)和廣泛應(yīng)用。

小型豬復(fù)合麻醉劑(XFM)是東北農(nóng)業(yè)大學(xué)外科教研室于2007年根據(jù)平衡麻醉的原理和小型豬的生理特點(diǎn),用噻環(huán)乙胺復(fù)合噻拉嗪和強(qiáng)痛靈等幾種麻醉劑,研制出的一種小型豬專用復(fù)合麻醉制劑XFM[5]。

本試驗(yàn)?zāi)康脑谟谕ㄟ^研究噻環(huán)乙胺及XFM麻醉下,大鼠不同腦區(qū)ACh的變化情況,探討噻環(huán)乙胺及小型豬復(fù)合麻醉劑(XFM)麻醉中樞作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及動(dòng)物 鹽酸噻環(huán)乙胺購自法國維克公司(純度99.83%),小型豬復(fù)合麻醉劑(XFM)由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)外科教研室研制(批號(hào):090425);大鼠專用乙酰膽堿檢測(cè)試劑盒購自美國Sigma公司;TGL-16G高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠),318MC型酶標(biāo)儀(上海三科儀器有限公司)。Wistar大鼠56只,購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),雌雄各半,體重 200±20 g。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組 Wistar大鼠56只,先隨機(jī)抽取8只為對(duì)照組。其余隨機(jī)均分為噻環(huán)乙胺組和XFM 組,每組又隨機(jī)均分為麻醉組、恢復(fù)Ⅰ組和恢復(fù)Ⅱ組3個(gè)亞組,每組8只。對(duì)照組大鼠:腹腔注射(ip)生理鹽水2 mL/kg,噻環(huán)乙胺組:ip噻環(huán)乙胺2 mL/kg,XFM組:ip XFM 2 mL/kg。對(duì)照組在注射后5 min斷頭取材,麻醉組、恢復(fù)Ⅰ組和恢復(fù)Ⅱ組分別在大鼠翻正反射消失即刻、翻正反射恢復(fù)即刻和翻正反射恢復(fù)后可直線爬行時(shí)斷頭取材,投入液氮快速冷凍,在生理鹽水冰面上迅速分離雙側(cè)大腦皮層、海馬、丘腦、小腦和腦干,分別稱重后立即-80℃冷凍保存。

1.3 ACh含量的測(cè)定 將不同腦區(qū)的腦組織投入裝有9倍容積(1/9,W/V)新鮮冷10%三氯乙酸的玻璃勻漿器中,冰浴下勻漿;勻漿液于,10 000 r/min(4℃)離心15 min,取上清液待測(cè)。本試驗(yàn)采用ELISA檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用SAS 6.12數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,各組均數(shù)的比較采用方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠麻醉情況 大鼠ip噻環(huán)乙胺2 mL/kg后,逐漸表現(xiàn)為行動(dòng)遲緩、共濟(jì)失調(diào)、后肢無力、最后倒臥不動(dòng)、翻正反射消失,進(jìn)入麻醉期;翻正反射恢復(fù)時(shí),大鼠呼吸增快、頭與四肢擺動(dòng),努力翻身;恢復(fù)反正反射的大鼠,先轉(zhuǎn)圈或斜線緩慢爬行,最后可直線爬行,但行為依然緩慢。

大鼠ip XFM 2 mL/kg后,麻醉情況與噻環(huán)乙胺組基本一致,但麻醉期明顯短于噻環(huán)乙胺組,且蘇醒迅速,翻正反射恢復(fù)后,很快可以直線爬行。

從噻環(huán)乙胺與XFM麻醉全過程可見,噻環(huán)乙胺麻醉誘導(dǎo)期短且平穩(wěn)(無興奮現(xiàn)象),麻醉時(shí)間長,蘇醒緩慢;與噻環(huán)乙胺比較,XFM麻醉誘導(dǎo)期短且平穩(wěn)(無興奮現(xiàn)象)(P＞0.05)、麻醉時(shí)間適宜(P＜0.05)、蘇醒迅速(P＜0.01)等特點(diǎn),結(jié)果見表1。

2.2 噻環(huán)乙胺及XFM對(duì)大鼠不同腦區(qū)ACh含量的影響 大鼠ip噻環(huán)乙胺2 mL/kg后,在麻醉組中,大腦皮層、海馬和丘腦內(nèi)ACh含量均顯著降低,與對(duì)照組比較,分別降低了34.02%(P＜0.01)、31.24%(P＜0.01)和49.5%(P＜0.01);在恢復(fù)Ⅰ組中,除了大腦皮層中ACh含量仍未恢復(fù)(P＜0.05)外,海馬和丘腦中ACh含量均顯著恢復(fù)(P＞0.05);在恢復(fù)Ⅱ組中,上述各腦區(qū)內(nèi)ACh含量均顯著恢復(fù)(P＞0.05);同時(shí)與麻醉組比較,差異顯著或極顯著(P＜0.05或P＜0.01)。而各組中小腦和腦干內(nèi)ACh含量均無顯著變化(P＞0.05)。

表1 大鼠麻醉情況,n=48) (min)

表1 大鼠麻醉情況,n=48) (min)

**:P＜0.01,差異極顯著;*:P＜0.05,差異顯著

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大鼠ip XFM 2 mL/kg后,在麻醉組中,大腦皮層和丘腦內(nèi)ACh含量均顯著降低,與對(duì)照組比較,分別降低了38.47%(P＜0.01)和56.42%(P＜0.01);在恢復(fù)Ⅰ組和恢復(fù)Ⅱ組中,上述腦區(qū)內(nèi)ACh含量均顯著恢復(fù)(P＞0.05),同時(shí)與麻醉組比較,差異顯著或極顯著(P＜0.05或P＜0.01)。而各組中海馬、小腦和腦干內(nèi)ACh含量均無顯著變化(P＞0.05)。結(jié)果見表2。

表2 噻環(huán)乙胺及XFM對(duì)大鼠不同腦區(qū) ACh含量的影響,n=8) (pmol/mg濕組織)

表2 噻環(huán)乙胺及XFM對(duì)大鼠不同腦區(qū) ACh含量的影響,n=8) (pmol/mg濕組織)

與對(duì)照組比較,**:P＜0.01,差異極顯著;*:P＜0.05,差異顯著。與麻醉組比較,▲▲:P＜0.01,差異極顯著;▲:P＜0.05,差異顯著

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從表2中可以看出,在噻環(huán)乙胺組中,大腦皮層、海馬和丘腦中ACh含量的變化趨勢(shì)與大鼠行為學(xué)變化情況基本一致;而小腦和腦干中ACh含量變化趨勢(shì)不明顯,與大鼠行為學(xué)變化情況無規(guī)律可循。在XFM組中,大腦皮層和丘腦中ACh含量的變化趨勢(shì)與大鼠行為學(xué)變化情況基本一致;而海馬、小腦和腦干中ACh含量變化趨勢(shì)不明顯,與大鼠行為學(xué)變化情況無規(guī)律可循。

3 討論

3.1 由于 ACh本身很不穩(wěn)定,釋放后極易被AChE水解,而且ACh和膽堿的分子中都沒有生色團(tuán)、熒光團(tuán)和電活性基團(tuán),因而對(duì)ACh的測(cè)定很困難[6]。有人應(yīng)用 ACh合成酶-膽堿乙?；?ChAT)或AChE的活力間接地表示的ACh含量,但AChE主要分布在突觸后膜,并不能準(zhǔn)確的代表ACh的分布狀況,而Houser經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)ACh和ChAT的分布在基底前腦、海馬等部位是一致的,但在大腦皮質(zhì)和丘腦上部等部位則不一致[7]。目前已有不少方法來直接測(cè)定ACh,如放射免疫法,靈敏度、特異性高,但需要制備抗ACh,且操作過程繁瑣,重現(xiàn)性不太好;熒光分光測(cè)定法,操作簡便,但靈敏度不高;高效液相法,組織樣本處理簡單,靈敏度、特異性強(qiáng),但測(cè)定時(shí)需制備成衍生物,且對(duì)色譜柱、檢測(cè)器電極等的要求高,設(shè)備昂貴[9]。本試驗(yàn)采用ELISA檢測(cè)腦組織中ACh的含量,本法操作簡便,靈敏度高(可達(dá)pmol水平),特異性強(qiáng),且對(duì)操作人員健康無危害。

3.2 目前還未見有關(guān)噻環(huán)乙胺及其復(fù)合制劑對(duì)中樞ACh含量影響的報(bào)道,僅有少量關(guān)于其同類藥氯胺酮的研究,結(jié)果顯示氯胺酮麻醉下丘腦內(nèi)ACh含量顯著下降[1];孫緒德、袁紅、葛曉群等的研究顯示,安氟醚、水合氯醛、嗎啡均能降低中樞 ACh的含量[3-4,11]。這與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,大鼠ip臨床相關(guān)劑量的噻環(huán)乙胺后,大腦皮層、海馬和丘腦內(nèi)ACh含量顯著降低,而小腦和腦干內(nèi)ACh含量未見明顯變化;ip XFM 后,大腦皮層和丘腦內(nèi)ACh含量顯著降低,而海馬、小腦和腦干內(nèi)ACh含量未見明顯變化。噻環(huán)乙胺和XFM麻醉全過程中,ACh含量變化趨勢(shì)與大鼠麻醉情況基本一致。這說明噻環(huán)乙胺和XFM對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)各腦區(qū)的作用具有選擇性,大腦皮層、海馬和丘腦可能是噻環(huán)乙胺中樞麻醉作用的靶位腦區(qū);大腦皮層和丘腦可能是XFM中樞麻醉作用的靶位腦區(qū)。抑制ACh在中樞的釋放和傳遞可能是噻環(huán)乙胺和XFM全麻作用的重要機(jī)制。XFM對(duì)海馬內(nèi)ACh產(chǎn)生抑制,但并不顯著,分析原因,可能是單獨(dú)使用噻環(huán)乙胺是可以引起ACh顯著下降,但比較大腦皮層和丘腦,下降程度要小;而噻環(huán)乙胺作為XFM 的一種成分與其他幾種麻醉劑復(fù)合使用時(shí),其含量沒有單獨(dú)使用時(shí)多,這樣不足以引起海馬內(nèi)ACh的顯著下降。

4 結(jié)語

試驗(yàn)結(jié)果表明,ACh參與了噻環(huán)乙胺和XFM的全麻中樞作用機(jī)制。噻環(huán)乙胺對(duì)大腦皮層、海馬和丘腦內(nèi)ACh的抑制、XFM對(duì)大腦皮層和丘腦內(nèi)ACh的抑制可能是其產(chǎn)生全身麻醉作用的重要機(jī)制之一。

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