董秋麗，夏方山，董寬虎

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷030801）

土壤鹽漬化是人類面臨的世界性問(wèn)題，全球約有100多個(gè)國(guó)家存在不同類型鹽堿地，占陸地面積的10%左右［1］，其引起的滲透脅迫已對(duì)植物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量造成了很大的影響。在滲透脅迫下，植物能否保持正常生長(zhǎng)狀況，關(guān)鍵在于能否維持體內(nèi)的水分平衡，而這正是通過(guò)積累一定量的溶質(zhì)，降低植物體內(nèi)的水勢(shì)實(shí)現(xiàn)的［2］。脯氨酸是公認(rèn)的在細(xì)胞中起著無(wú)毒滲透保護(hù)作用的細(xì)胞相溶性物質(zhì)，它被廣泛的積累在各器官中，Pro的積累受多種因素的調(diào)控，如：它自身的合成、分解，用于蛋白質(zhì)的合成及在不同器官中的運(yùn)輸［3］。植物的Pro合成、累積及代謝是一個(gè)受非生物脅迫和細(xì)胞內(nèi)Pro濃度調(diào)控的生理生化過(guò)程［4，5］。已證明植物體內(nèi)存在2條Pro合成途徑，根據(jù)起始氨基酸命名為Glu途徑和Orn途徑，P5CS和δ－OAT分別是這2個(gè)途徑的關(guān)鍵酶。支立峰等［6］用飛蛾豆（Vignaaconitifolia）中的P5CS基因轉(zhuǎn)化水稻（Oryzaglaberrima），再用250 mmol／L NaCl脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的Pro含量提高，同時(shí)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的耐鹽性比野生型增強(qiáng)。陳吉寶等［7］發(fā)現(xiàn)脅迫下普通菜豆幼苗葉和根中脯氨酸合成酶基因PvP5CS2的轉(zhuǎn)錄水平快速上升，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)錄水平逐漸下降；在逆境脅迫下，幼苗葉和根中Pro大量積累，高峰出現(xiàn)在Pv P5CS2基因表達(dá)高峰之后。徐春波等［8］將P5CS去除反饋抑制的突變型P5CS－F129A基因轉(zhuǎn)入冰草（Agropyron）導(dǎo)致植物體中Pro含量成倍增加。這些結(jié)果均說(shuō)明，PvP5CS2基因的表達(dá)受干旱、高鹽和冷脅迫誘導(dǎo)，Pro積累受PvP5CS2基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。Roosens等［9］發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)δ－OAT基因煙草合成的Pro在無(wú)脅迫時(shí)比對(duì)照高3倍，且組成型超表達(dá)δ－OAT基因并沒(méi)有影響植物在正常條件下的生長(zhǎng)；在0.2 mol／L NaCl或等滲的甘露醇脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系積累的Pro比對(duì)照高1.5倍，而且有更高的生物量和萌發(fā)率。有研究表明，不同植物、不同組織、不同生理?xiàng)l件下2條途徑對(duì)Pro積累的貢獻(xiàn)大小存在差異［10］。Pro合成過(guò)程中究竟是哪一條途徑居于主導(dǎo)地位，還有待進(jìn)一步研究。

芨芨草（Achnatherumsplendens）屬禾本科芨芨草屬旱中生多年草本植物，也是一種泌鹽植物，具有很強(qiáng)的抗鹽堿性［11，12］。目前，對(duì)于芨芨草耐鹽性的研究很少［12，13］，多見(jiàn)于種植芨芨草生態(tài)經(jīng)濟(jì)效益方面的研究。而通過(guò)生物措施進(jìn)行鹽堿地改良是經(jīng)濟(jì)長(zhǎng)久的方法，牧草在鹽堿地改良利用中具有重要作用和利用前景［14］。因此，研究芨芨草鹽脅迫下的生理變化及耐鹽性機(jī)理，對(duì)于改良鹽堿草地具有重要的實(shí)踐意義。對(duì)其苗期鹽脅迫下Pro代謝途徑進(jìn)行研究，明確在鹽脅迫下芨芨草的Pro代謝途徑及在不同器官中的運(yùn)輸，以期為鹽堿地植被恢復(fù)與改良提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試草種及來(lái)源

試驗(yàn)用芨芨草種子于2008年10月13日采自山西省偏關(guān)縣天峰坪鎮(zhèn)梨園村的農(nóng)田地埂，海拔1 018 m，111°22′19.1″E，39°27′56.8″N。

1.2 試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系日光能溫室進(jìn)行。將種子（100粒／盆）播種于蛭石與珍珠巖體積比為1∶1的塑料盆中（直徑25 cm、高20 cm），插入PVC管以便澆水及營(yíng)養(yǎng)液，置于晝夜溫度為25／17℃，相對(duì)濕度為65%～80%的溫室條件下進(jìn)行培養(yǎng)。出苗后，每隔2 d用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌1次，處理于17：00－20：00時(shí)進(jìn)行。其余時(shí)間用蒸餾水補(bǔ)充失水，以稱重法確定失水量，當(dāng)苗齡達(dá)2～3周時(shí)每盆定苗60株。當(dāng)出苗7周后對(duì)其進(jìn)行鹽分脅迫，以0（CK），100，200，300，400和500 mmol／L NaCl 6個(gè)濃度的營(yíng)養(yǎng)液為處理液，隔天按100 mmol／L梯度進(jìn)行遞增，直至達(dá)到指定濃度，對(duì)照只灌完全營(yíng)養(yǎng)液，3次重復(fù)，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。每組鹽脅迫1周后，分別采集其葉片和根系，置于－80℃冰箱保存，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 Pro含量的測(cè)定 按照Bates等［15］的方法。

1.3.2 P5CS的測(cè)定 P5CS的抽提方法按照Kavi Kishor等［16］的方法進(jìn)行。蛋白含量以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，按照Bradford［17］的方法。P5CS活性測(cè)定按照 Garcia－Rios等［18］的方法進(jìn)行。

1.3.3 δ－OAT活性的測(cè)定 粗酶提取按照Roosens等［19］的方法進(jìn)行，蛋白含量以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，參照Bradford［17］的方法。

δ－OAT活性的測(cè)定參照Kim等［20］的方法，略做改動(dòng)。反應(yīng)體系為：50 mmol／L的磷酸緩沖液、35 mmol／L L－鳥氨酸、5 mmol／Lα－酮戊二酸和0.05 mmol／L磷酸吡哆醛混合，總體積為0.9 m L，再加入0.1 m L酶液，在25℃條件下反應(yīng)20 min后加入0.3 m L 3 mol／L的高氯酸終止反應(yīng)，然后加入0.2 m L 2%茚三酮沸水中加熱20 min染色，冷卻后10 000 r／min離心棄去上清液；用1.5 m L無(wú)水乙醇溶解紅色沉淀物，離心后取上清液510 nm測(cè)定吸光值。產(chǎn)物吡咯啉－5－羧酸（P5C）與茚三酮生成的紅色物質(zhì)摩爾消光系數(shù)為16.5 L／（mmol·cm）。以每min生成0.001 mmol P5C的量為1個(gè)δ－OAT活性單位（U）。

1.3.4 ProDH的測(cè)定 參照Lutts等［21］方法提取，略做改動(dòng)。樣品加4倍體積提取緩沖液（w／v）于冰浴中研磨，提取緩沖液為0.1 mol／L Na2HPO4－KH2PO4（p H 7.8），內(nèi)含1 mmol／L EDTA，10 mmol／L巰基乙醇。勻漿液經(jīng)3層紗布過(guò)濾后3 898 r／min離心15 min。上清液加Triton X－100至終濃度0.15%，渦懸后于冰浴中放置30 min，后于19 491 r／min離心20 min，上清液測(cè)酶活性。

活性測(cè)定反應(yīng)混合液體積為2.5 m L，內(nèi)含0.15 mol／L Na2CO3－Na HCO3（p H 10.3）緩沖液1.6 m L，0.2 m L 0.1 mol／L L－Pro，0.2 m L 0.9 mmol／L 2，6－二氯酚靛酚。30℃水浴中保溫5 min，加入0.5 m L（0.8 mg蛋白／m L）酶提取液，混合均勻后加入0.2 m L吩嗪硫酸甲酯試劑PMS（9 mg／m L，現(xiàn)配），搖勻后立即于600 nm下檢測(cè)光密度變化。以每min A600減少0.001為1個(gè)ProDH酶活單位（U）。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003及SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫對(duì)芨芨草Pro含量的影響

隨著NaCl濃度的增加，芨芨草植株根系與葉片中Pro的含量均呈上升趨勢(shì)（表1），且均顯著高于對(duì)照（P＜0.05）；在同一濃度脅迫下，芨芨草葉片中Pro的含量均顯著高于根系（P＜0.05），為根系的1.93～7.92倍；當(dāng)NaCl濃度為500 mmol／L時(shí)，芨芨草植株根系與葉片中Pro含量均達(dá)到最大值，為303.36和585.77μg／g FW（鮮重），分別是對(duì)照的74和18倍。隨著NaCl濃度的增加，芨芨草根系中Pro含量上升的幅度大于葉片。芨芨草植株根系與葉片中Pro含量的急劇上升，說(shuō)明芨芨草對(duì)NaCl脅迫的適應(yīng)能力較強(qiáng)。

表1 NaCl脅迫下芨芨草根系與葉片Pro含量的變化Table 1 Changes of proline content in A.splendens under NaCl stress μg／g FW

2.2 NaCl脅迫對(duì)P5CS活性的影響

除200 mmol／L NaCl濃度脅迫時(shí)，芨芨草根系與葉片P5CS活性差異不顯著外（P＞0.05），其他濃度脅迫下，芨芨草根系中的P5CS活性均顯著高于葉片（P＜0.05）。在不同濃度NaCl脅迫下，除200 mmol／L濃度脅迫時(shí)，芨芨草根系中的P5CS活性與對(duì)照差異不顯著外（P＞0.05），其余濃度脅迫下，芨芨草根系中P5CS活性均顯著高于對(duì)照（P＜0.05）；NaCl濃度為300 mmol／L時(shí)，芨芨草葉片中P5CS活性顯著高于對(duì)照外（P＜0.05），其他濃度脅迫下，芨芨草葉片中P5CS活性均顯著低于對(duì)照（P＜0.05）。當(dāng)NaCl濃度為300 mmol／L時(shí)，芨芨草葉片與根系中P5CS活性均達(dá)到最大值，為7.44和20.81 U／mg蛋白，分別為對(duì)照的1.1和6.3倍。在NaCl的脅迫下，隨著鹽濃度的增加，芨芨草葉片P5CS的活性呈“降－升－降”的趨勢(shì)（圖1）。

圖1 NaCl脅迫下芨芨草根系與葉片P5CS活性的變化Fig.1 Changes of P5CS in A.splendens under NaCl stress

2.3 NaCl脅迫對(duì)δ－OAT活性的影響

在NaCl脅迫下，芨芨草根系中的δ－OAT活性顯著高于葉片中的（P＜0.05）；芨芨草葉片與根系中的δ－OAT活性均顯著低于對(duì)照（P＜0.05），但在不同濃度的NaCl脅迫下，δ－OAT活性的變化幅度不大。隨著鹽濃度的增加，葉片與根系中的δ－OAT活性均呈先下降后上升的趨勢(shì)。當(dāng)NaCl濃度為300和400 mmol／L時(shí)，芨芨草根系與葉片中的δ－OAT活性降至最低，較對(duì)照分別降低45.87%和72.24%（圖2）。這說(shuō)明NaCl脅迫下，芨芨草中δ－OAT活性受到抑制，所以Pro含量的急劇上升可能不是通過(guò)鳥氨酸途徑合成的。

2.4 NaCl脅迫對(duì)ProDH活性的影響

在NaCl脅迫下，芨芨草葉片中ProDH酶的活性均顯著高于根系中的（P＜0.05），且均顯著高于對(duì)照（P＜0.05）。隨著NaCl濃度的增加，芨芨草葉片中ProDH的活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)NaCl濃度為200 mmol／L時(shí)，ProDH活性達(dá)到最大值，為66.04 U／g FW，是對(duì)照的1.7倍。芨芨草根系中的ProDH活性隨著NaCl濃度的增加變化不明顯，在濃度為100 mmol／L時(shí)，芨芨草根系中ProDH的活性上升到最大值為30.47 U／g FW，且顯著高于對(duì)照外（P＜0.05），其他濃度脅迫下，均差異不顯著（P＞0.05）。當(dāng) NaCl濃度為300 mmol／L時(shí)，芨芨草根系中ProDH 活性最小，為21.95 U／g FW，是對(duì)照的86.30%（圖3）。

3 討論

3.1 NaCl脅迫對(duì)芨芨草植株不同器官Pro含量的影響

在鹽脅迫下，Pro是公認(rèn)的滲透保護(hù)劑，各組織中游離Pro含量的多少，直接關(guān)系到其抗逆性的強(qiáng)弱。Pro能防止水分散失，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)的完整性，所以細(xì)胞內(nèi)Pro的升高可作為植物抗性的指標(biāo)［22］。近年來(lái)對(duì)鹽脅迫下植物的生理代謝調(diào)節(jié)方面的研究表明，在鹽脅迫的條件下胞質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生大量的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在正常生長(zhǎng)條件下，植物體內(nèi)的游離Pro含量較低，但在鹽堿脅迫下，游離Pro的含量明顯增加［23］。陳托兄等［24］也指出：抗鹽植物中游離Pro多集中于代謝旺盛的光合器官和生殖器官，其Pro的含量是其他部位的數(shù)倍到數(shù)十倍，在鹽逆境下植物優(yōu)先保護(hù)其光合器官和生殖器官，這是植物對(duì)鹽漬生境的一種生態(tài)適應(yīng)對(duì)策。張金林等［25］研究表明：NaCl脅迫下，湖南稷子（Echinochloacrusgalli）地上部的游離Pro是根中的10倍多。吳欣明等［26］研究表明：隨NaCl濃度的升高，7份羊茅屬（Festuca）植物葉綠素和光合速率呈遞減趨勢(shì)，Pro呈增高趨勢(shì)。孟林等［27］同樣證實(shí)了NaCl脅迫下，34份偃麥草屬（Elytrigia）植物種質(zhì)材料葉片的Pro隨脅迫濃度的增加而呈遞增趨勢(shì)，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致（表1）。芨芨草葉片中的Pro含量顯著高于根系中的，可能是由于在鹽逆境下植物為優(yōu)先保護(hù)其光合器官和生殖器官，將根系中合成的Pro運(yùn)輸?shù)饺~片。這與全先慶等［28］得出的Pro大多在植物的根中合成，而產(chǎn)物大部分被運(yùn)輸?shù)降厣喜糠值难芯拷Y(jié)果一致。造成芨芨草植株地上部Pro積累的原因還可能與植株地上部光呼吸乙醇酸途徑的激活和Glu脫氫酶的活化相關(guān)［15］，還有待進(jìn)一步的研究。Pro含量的大量增加，提高了緩解滲透脅迫的能力，從而增強(qiáng)了芨芨草植株在NaCl脅迫下的抗逆性。

圖2 NaCl脅迫下芨芨草根系與葉片δ－OAT活性的變化Fig.2 Changes ofδ－OAT in A.splendens under NaCl stress

圖3 NaCl脅迫下芨芨草根系與葉片ProDH活性的變化Fig.3 Changes of ProDH in A.splendens under NaCl stress

3.2 NaCl脅迫對(duì)芨芨草植株脯氨酸代謝途徑的影響

根尖部位是感知脅迫最敏感部位，植株受到的脅迫往往最先由根部感知，在此狀況下，其生理反應(yīng)可能與葉片的生理反應(yīng)不盡相同［4］。在NaCl脅迫下，除根系P5CS的活性顯著高于對(duì)照外（P＜0.05），芨芨草葉片中P5CS的活性、根系與葉片δ－OAT的活性均顯著低于對(duì)照（P＜0.05）。由此可見(jiàn)，芨芨草Pro的積累主要在根系中以谷氨酸途徑合成。研究表明，在滲透脅迫和低氮條件下谷氨酸途徑占主導(dǎo)地位，而在非脅迫條件及高氮條件下鳥氨酸又居于主導(dǎo)地位［29］。黃誠(chéng)梅等［30］的研究也表明，滲透脅迫下，甘蔗（Saccharumofficinarum）幼苗葉片Pro生物合成以谷氨酸－Pro途徑為主。這與本試驗(yàn)結(jié)論相一致。當(dāng)NaCl的濃度高于300 mmol／L時(shí)，葉片P5CS的活性開(kāi)始下降，可能是由于Pro濃度的大量增加，其活性受到Pro含量的反饋抑制［31］。ProDH是植物體內(nèi)控制Pro降解的關(guān)鍵酶，在滲透脅迫時(shí)其表達(dá)活性受到抑制［30］。在NaCl脅迫下，芨芨草葉片中的ProDH的活性顯著高于根系（P＜0.05），主要是由于ProDH基因被Pro誘導(dǎo)而被滲透脅迫抑制［2］?？梢?jiàn)，芨芨草Pro含量的積累是由合成和降解綜合作用的結(jié)果。

4 結(jié)論

NaCl脅迫下，芨芨草植株葉片的Pro含量顯著高于根系，芨芨草Pro含量隨NaCl脅迫濃度的增加而增加，當(dāng)NaCl濃度達(dá)500 mmol／L時(shí)，Pro含量最大。

芨芨草植株根系P5CS活性顯著高于對(duì)照，在同一濃度脅迫下，根系活性均高于葉片；隨著NaCl濃度的增加，δ－OAT活性呈降低趨勢(shì)，均顯著低于對(duì)照；葉片ProDH活性高于對(duì)照，而根系ProDH活性較對(duì)照變化不太明顯。

NaCl脅迫下，芨芨草植株內(nèi)Pro的積累主要以谷氨酸途徑為主。

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