程 鵬 ，劉 清 ，彭 瓊 ，趙嚴(yán)偉 ，龔 曉

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物激素與生長發(fā)育湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128;2.湖南省作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點實驗室，湖南 長沙 410128)

常規(guī)育種與生物技術(shù)育種相結(jié)合是作物育種的發(fā)展趨勢[1]。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)基因研究始于20世紀(jì)90年代初。轉(zhuǎn)化秈稻體系的優(yōu)化有諸多報道，Aldemita等[2]轉(zhuǎn)化秈稻，其穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率僅在1%～5%之間。由于秈稻基因型較多，影響轉(zhuǎn)化率的因素較為復(fù)雜，從而增大了秈稻轉(zhuǎn)化技術(shù)的復(fù)雜性。本研究著重探討不同激素配比、菌液濃度、侵染時間、潮霉素敏感性等因素對農(nóng)桿菌共轉(zhuǎn)化秈型親本的影響，以期能與前人的研究結(jié)果互為補充，建立一個轉(zhuǎn)化率高、穩(wěn)定性好的農(nóng)桿菌共轉(zhuǎn)化體系，并利用此體系獲得有價值的轉(zhuǎn)基因植株。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

秈型雜交稻親本（Oryza Sativa L.subsp indica）II32B由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻科學(xué)研究所提供。工程質(zhì)粒pCAMBIA1300（簡稱p1300，僅含抗潮霉素抗性基因），p13w8（僅含反義蠟質(zhì)基因）均由上海植物生理生態(tài)研究所提供。

1.2 培養(yǎng)基配置

愈傷組織誘導(dǎo)和分化的培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基是NB培養(yǎng)基，即N6培養(yǎng)基的大量元素，B5培養(yǎng)基的微量元素和有機(jī)附加物，添加酶解酪蛋白500 mg/L，脯氨酸 500 mg/L，瓊脂粉 8 g/L，蔗糖 30 g/L，pH 5.8。按表1添加不同濃度的2，4-D、NAA、KT和6-BA，觀察愈傷組織的生長狀態(tài)并統(tǒng)計誘導(dǎo)率和分化率。共轉(zhuǎn)化所用的其他培養(yǎng)基配方如表2所示。

表1 愈傷組織誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基中植物激素類物質(zhì)的組合 （mg/L）

表2 共轉(zhuǎn)化所用培養(yǎng)基

1.3 水稻愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)

將水稻種子去殼，每200粒種子為1個處理，依次用70%乙醇浸泡5 min，0.1%升汞浸泡8 min，1%次氯酸鈉處理35 min消毒；無菌水沖洗6～8次，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，27±1℃下暗培養(yǎng)5～10 d誘導(dǎo)愈傷組織，待胚芽長到1 cm，嚴(yán)格挑選質(zhì)量好的無菌胚性盾片愈傷組織繼代數(shù)次。

1.4 農(nóng)桿菌菌液濃度和侵染時間

根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)參照Hiei等[3]的方法。將質(zhì)地、大小和生理狀態(tài)基本一致的愈傷組織分兩組處理：第1組農(nóng)桿菌菌液OD600值分別為0.4、0.6、0.8、1.0和1.2，侵染10 min；第2組菌液 OD600值0.8，分別侵染2、5、10、15和20 min。經(jīng)共培養(yǎng)后統(tǒng)計和比較不同處理的愈傷組織狀態(tài)，然后經(jīng)篩選培養(yǎng)，統(tǒng)計愈傷組織污染率和存活率，確定最佳的農(nóng)桿菌菌液濃度和侵染時間。

1.5 潮霉素篩選濃度的確定

以成熟胚愈傷組織為材料，在選擇培養(yǎng)基中分別加入 0、10、20、30、40 、50 mg/L 的潮霉素（Hyg），每處理3皿，3次重復(fù)，20 d后統(tǒng)計愈傷組織的存活率。

1.6 轉(zhuǎn)化植株的DNA提取和PCR檢測

取水稻植株葉片0.1 g，按照Edwards[4]的方法提取基因組DNA，檢測p13W8引物為W8P1（5’-CTC TCGGAGAGGTTCAGCTG-3’）和 W8P2（5’-ATGAT AATCATCGCAAGATC-3’)，PCR 反應(yīng)條件為 94℃預(yù)變性 2 min，然后 94℃變性 35 s，55℃退火 30s，72℃延伸30 s，循環(huán)30次，PCR產(chǎn)物大小為450 bp。檢測 p1300 引物為 Hyg1（5’-GCTTCTGCGGGCGATTT GTGT-3’）和 Hyg2（5’-GGTCGCG AGGCTATGG AT GC-3’），PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性 45 s，58℃退火 45 s，72℃延伸 1 min，循環(huán)30次，PCR產(chǎn)物大小為598 bp。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物激素類物質(zhì)的組合對愈傷組織誘導(dǎo)和分化的影響

培養(yǎng)基中激素的種類和配比，對愈傷組織的形成和分化起決定作用。供試材料II32B在M8培養(yǎng)基中愈傷組織誘導(dǎo)率最高（圖1）。從外形上看，這些愈傷組織比較致密、較硬，呈顆粒狀結(jié)構(gòu)較多；而在沒有添加2，4-D的培養(yǎng)基中愈傷組織誘導(dǎo)率極低；在分化培養(yǎng)基中加入1.0 mg/L NAA、0.5 mg/L KT和2 mg/L 6-BA，分化率達(dá)25.6%～31.4%。資料顯示[5－6]，2，4-D 是誘導(dǎo)愈傷組織最有效的物質(zhì)，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂周期蛋白的合成，控制脫分化和細(xì)胞分裂重新啟動；2，4-D與作用緩和的NAA聯(lián)合，再配合一定濃度的細(xì)胞分裂素，既有利于細(xì)胞的持續(xù)分裂，又促進(jìn)后期苗的分化。因此，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基中附加NAA、KT和6-BA可以改進(jìn)愈傷組織質(zhì)量，從而提高再生頻率。

圖1 不同植物激素類物質(zhì)的組合對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.2 農(nóng)桿菌菌液濃度和侵染時間對愈傷轉(zhuǎn)化頻率的影響

農(nóng)桿菌菌液濃度和侵染時間對轉(zhuǎn)化頻率的影響很大，菌液濃度過高或侵染時間過長，都會導(dǎo)致受體死亡，很難得到轉(zhuǎn)化體。菌液濃度過低或侵染時間過短，不能讓足夠的農(nóng)桿菌附著于受體愈傷組織，大大降低轉(zhuǎn)化頻率。從表3可以看出，OD600值為0.8時，II32B愈傷存活率最高，約為28.7%，篩選培養(yǎng)時農(nóng)桿菌污染轉(zhuǎn)少；OD600值超過1.2時死亡愈傷數(shù)增多，并且篩選培養(yǎng)時出現(xiàn)農(nóng)桿菌污染，大量的農(nóng)桿菌覆蓋在愈傷組織上抑制其生長。

從表4可以看出，侵染時間10 min時，轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的頻率較高，侵染時間延長至15～20 min時，較難獲得轉(zhuǎn)化體。侵染時間2 min時，獲得的抗性愈傷數(shù)較侵染10 min明顯減少。因此，供試材料II32B適宜的農(nóng)桿菌菌液濃度OD600為0.8，侵染時間為10 min。

表3 農(nóng)桿菌菌液濃度對水稻愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的影響 （%）

2.3 潮霉素敏感性試驗

在對轉(zhuǎn)化愈傷組織進(jìn)行抗性篩選時，如果Hyg濃度過高會造成愈傷組織迅速死亡，而細(xì)胞在死亡過程中會分泌大量次生代謝物質(zhì)，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長受到抑制，影響轉(zhuǎn)化效率；而Hyg濃度太低則不能有效的抑制非轉(zhuǎn)化愈傷組織生長，容易使非轉(zhuǎn)化細(xì)胞逃逸。對II32B成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織進(jìn)行敏感性試驗表明，較低濃度的Hyg能抑制其生長，Hyg濃度達(dá)到40 mg/L時愈傷組織褐化嚴(yán)重，50 mg/L時愈傷組織褐化致死。圖2結(jié)果表明比較理想的Hyg篩選濃度為30 mg/L。

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

采用共轉(zhuǎn)化方法獲得再生植株71株，PCR檢測表明，有43個樣品檢測到598 bp的抗潮霉素抗性基因片段，占再生植株總數(shù)的60.6%。有8個樣品檢測到450 bp的反義蠟質(zhì)基因片段（圖3），占再生植株總數(shù)的11.2%。反義蠟質(zhì)基因檢測為陽性的植株，潮霉素抗性基因的PCR檢測也為陽性，這表明本研究獲得了含有反義蠟質(zhì)基因的轉(zhuǎn)基因植株。

圖2 不同濃度潮霉素對愈傷組織成活率的影響

圖3 再生植株中反義蠟質(zhì)基因的PCR檢測

3 討論

農(nóng)桿菌共轉(zhuǎn)化法是一個細(xì)菌和愈傷組織共同作用的復(fù)雜過程。凡是涉及到細(xì)菌活性或愈傷組織狀態(tài)的因素都可能影響轉(zhuǎn)化效果。本研究試圖從轉(zhuǎn)化前不同激素配比來改進(jìn)愈傷組織質(zhì)量、轉(zhuǎn)化中菌株狀態(tài)、侵染時間等轉(zhuǎn)化過程本身因素以及潮霉素篩選濃度等方面來探討其對轉(zhuǎn)化率的影響，取得了較為理想的效果。應(yīng)用此轉(zhuǎn)化體系，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化率較常規(guī)轉(zhuǎn)化方法有了顯著的提高，但是研究表明農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻的影響因素紛繁復(fù)雜，要建立一個轉(zhuǎn)化率高、穩(wěn)定性好、通用性強(qiáng)的水稻農(nóng)桿菌共轉(zhuǎn)化體系還需要深入系統(tǒng)的研究。

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[3] Hiei Y,Ohta T,Komari T,et a1.Efficient transformation of rice mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA[J].Plant J,1994,6：271-282.

[4] Edwards K,Johnstone C,Thompson C.A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis.Nucleic Acids Research,1991,1（6）：1349.

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