胡雙豐 胡志剛

1 寧波市藥品檢驗所（315040）

2 寧波四明大藥房有限責任公司（315000）

《中國藥典》（2005年版一部）收載的三七含量測定方法，系采用HPLC法測定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1三種成分的總量[1]。但在該項檢測中，對色譜條件所規(guī)定的洗脫梯度和供試品溶液的制備方法操作起來頗感費時，筆者對此兩點試作了一些改進（除此兩點外，其余仍按原有規(guī)定執(zhí)行），使操作時間大為縮短，收效良好，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀系列（美國），DAD二極管陣列檢測器；METTLER. CP225D電子分析天平（上海）。

1.2 試藥

對照品：①三七皂苷R1（批號110745-200312）；②人參皂苷Rg1(110703-200726，含量97.7%)；③人參皂苷Rb1(110704-200420)，均為中國藥品生物制品檢定所提供（供含量測定用）。供試品：三七（粉）3批，飲片均為寧波市藥材公司最近兩年商品，以下簡稱S1、S2、S3。所用化學試劑為色譜純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備方法改進

2.1.1 藥典原有供試品溶液制備方法

取本品粉末（過四號篩）0.6g，精密稱定，精密加入甲醇50ml，稱定重量，放置過夜，置80℃水浴上保持微沸2h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 改進后的供試品溶液制備方法

取本品粉末（過四號篩）0.6g，精密稱定，精密加入甲醇50mL，稱定重量，放置2h，時時振搖，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件中流動相洗脫梯度改進

2.2.1 藥典原有色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以水為流動相B，按下表中的規(guī)定進行梯度洗脫；；檢測波長為203nm，理論板數(shù)按三七皂苷R1峰計算應(yīng)不得低于4000（表1）。

表1 藥典規(guī)定的梯度洗脫

2.2.2 改進后流動相洗脫梯度

見表2[2]。

表2 改進后的梯度洗脫

2.3 實驗中保持不變的其他相關(guān)因素

2.3.1 未加改動的色譜條件部分

色譜柱為VenusllXBP-C18，4.6 mm×150mm 5μm；柱溫35℃，柱壓80bar， 進樣量10μL， 流動相（乙腈-水，梯度）流速1.0mL/min，每針stop time=23.50min（或cp方法66min），post time=3.0min；檢測器DAD，檢測波長203nm，積分參數(shù)：Slope=5；peak width=0.05。對照品溶液濃度：每1mL含三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1分別為0.1032、0.4272、0.4236mg（溶劑為甲醇）。

理論板數(shù)（N）按三七皂苷R1峰計算，采取改進方法所測得的N值為28376（遠大于4000）；人參皂苷Rg1與三七皂苷R1的分離度R= 5.43，人參皂苷Rb1與前一峰的R=2.17，均＞2，符合藥典要求。采用改進的方法操作，每針運行的時間從66min減少到23min。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1 3種被測成分的保留時間（tR）分別是9.373、10.604、20.635min；然而采用藥典的方法操作，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1 3種成分的tR分別是23.402、26.983、54.794min，節(jié)約時間一半以上。兩種方法的HPLC圖譜見圖1～圖4。

2.4 加樣回收率試驗

取已知含量的供試品（S1）5份，每份0.3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入每1mL各含0.2mg的人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1以及含0.05mg的三七皂苷R1對照品溶液1mL，采取改進的方法制備供試品溶液和改良的梯度洗脫，注樣測定，計算加樣回收率，結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1三者的加樣回收率分別是95.45%、99.21%、98.13%，RSD分別是2.1%、1.7%、1.8%。

圖1 采用改進方法所得HPLC圖譜-1（壘加圖）

圖2 采用改進方法的HPLC圖譜-2（疊加圖）

圖3 采用藥典方法的HPLC圖譜-1

圖4 采用藥典方法的HPLC圖譜-2

2.5 精密度試驗

取同一份供試品溶液（S1），重復進樣5次，RSD=0.42% (n=5)。

2.6 重復性試驗

取同一批供試品（S1），精密稱取5份，每份0.6g，按改進方法制備供試品溶液和改良的梯度洗脫，注樣分析，計算總含量，RSD為1.5% (n=5)。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一份供試品溶液（S1）分別在制備后0、1、4、8、24、48h進行分析，記錄峰面積，RSD為2.0%。表明溶液在48h內(nèi)相對穩(wěn)定。

2.8 樣品測定結(jié)果

取上述3批三七粉末，每批平行取樣6份，每份取0.6g，精密稱定。每2份一組，共3組，第一組選用改進的流動相操作，但供試品溶液提取方法仍按照藥典進行；第二組選用改進的流動相和超聲提取方法操作；第三組完全照藥典方法操作。分別制備樣品溶液及對照品溶液，各取10μL進樣測定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1峰面積，以峰面積外標法計算3種成分的總含量（規(guī)定按干燥品計算，3種成分總量不得少于5.0%），結(jié)果如下（表3～表5）。

表3 采用改進方法的測定結(jié)果-1

表4 采用改進方法的測定結(jié)果-2（超聲提?。?/p>

表5 采用藥典方法的測定結(jié)果

3 小結(jié)與討論

3.1 從3批樣品測定結(jié)果看，第一組與第三組比較，改進流動相的洗脫梯度與藥典洗脫梯度的含量測得值基本相當；第二組與第三組比較，兩組的含量值也很接近，即表明無論改良流動相的洗脫梯度，還是改進供試品溶液提取方法，都不影響目標成分含量的準確測定，而只會縮短檢測時間，簡化操作步驟，節(jié)儉人力物力。如按藥典方法，原本需要2d的工作，選用本文的改進方法則僅需1d即可完成。從方法考察結(jié)果看，本文的改進方法具有較好的精度和準確性，可用于三七含量測定。

3.2 在供試品溶液制備中，超聲提取前必須冷浸[3]，至少2h，若加以振搖則更佳，以促使植物細胞膨脹，被測組分易于釋放溶出，而浸出雜質(zhì)相對較少。

[1]國家藥典委員會.中國藥典[S]. 2005年版. 一部. 北京:化學工業(yè)出版社,2005:10

[2]國家藥品監(jiān)督管理局:國家藥品標準(試行)WS3-B-3590-2001(Z)[S].2001.

[3]中國醫(yī)科院藥物研究所.中草藥現(xiàn)代研究[S].第三卷.北京:北京醫(yī)科大學中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社,1997:193.