蔣青鋒 陳志良 包 杰 劉喜榮 武金寶,4*

1 南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院藥學部（510515）

2 湖南玉新藥業(yè)有限公司（410007）

3 南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院檢驗科（510515）

4 包頭醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院內(nèi)蒙古消化病研究所（014030）

納米生物技術(shù)是國際生物技術(shù)領域的前沿和熱點問題，美國、日本、德國等國家均已將納米生物技術(shù)作為21世紀的科研優(yōu)先項目予以重點發(fā)展。特別是納米藥物載體將來會在疾病的診斷、治療和衛(wèi)生保健等方面發(fā)揮重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L929細胞株（南方醫(yī)科大學病理教研室提供），銀杏內(nèi)酯（上海傲拓信息科技有限公司），胰酶，噻唑藍(MTT)和DMSO (購自Sigma公司)，培養(yǎng)基RPMI 1640 (Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青)，96孔和6孔細胞培養(yǎng)板（Corning公司，美國），酶標儀(GE，美國)，AU5421全自動生化分析儀(Olympus，日本)。

1.2 實驗方法

1.2.1 銀杏內(nèi)酯納米粒的制備

采用表面聚合法制備銀杏內(nèi)酯PELGE納米粒[1,2]。

1.2.2 實驗分組與試驗處理

實驗分銀杏內(nèi)酯納米粒組（實驗組）、銀杏內(nèi)酯藥物組（藥物對照組）、空白納米粒組（載體對照組）3組，分別用含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液溶解，按照試驗需要制備100、75、50、25和1 mg/L 5個濃度劑量組，0.22μm微孔濾膜過濾除菌備用。

1.2.3 L929細胞培養(yǎng)

細胞在含10%胎牛血清（56℃熱滅活30min）的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)生長。細胞密度為1×109個/L，每1～2d傳代一次，取指數(shù)生長期細胞用于實驗。

表1 不同濃度銀杏內(nèi)酯納米粒處理組對培養(yǎng)L929細胞LDH釋放的影響（n=3，±s）

表1 不同濃度銀杏內(nèi)酯納米粒處理組對培養(yǎng)L929細胞LDH釋放的影響（n=3，±s）

組別對照組 100g/L 75g/L 50g/L LDH 活性(U/L) 25.00±1.00 26.67±1.15 26.00±1.00 25.33±1.15 1.405 0.311測定項目F P

表2 不同濃度銀杏內(nèi)酯藥物（不含PBCA）處理組對培養(yǎng)L929細胞LDH釋放的影響（n=3，±s）

表2 不同濃度銀杏內(nèi)酯藥物（不含PBCA）處理組對培養(yǎng)L929細胞LDH釋放的影響（n=3，±s）

組別對照組 100g/L 75g/L 50g/L LDH 活性(U/L) 25.00±1.00 26.00±1.00 26.33±2.08 25.67±0.58 0.583 0.642測定項目F P

表3 空白納米粒（PBCA）處理組對培養(yǎng)L929細胞LDH釋放的影響（n=3，±s）

表3 空白納米粒（PBCA）處理組對培養(yǎng)L929細胞LDH釋放的影響（n=3，±s）

對照組 100g/L 75g/L 50g/L LDH 活性(U/L) 25.00±1.00 26.00±1.00 25.00±1.00 24.67±1.15 0.923 0.472測定項目 組別F P

1.2.4 細胞存活率的測定

于96孔培養(yǎng)板接種L929細胞，每孔加入100μL，培養(yǎng)24h后，棄去原培養(yǎng)基，PBS液洗滌兩次，實驗組分別加入不同濃度的銀杏內(nèi)酯納米粒、空白納米粒（PBCA）和銀杏內(nèi)酯藥物（不含PBCA），對照組加入培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)2、4、7d，在各觀察期取出一塊培養(yǎng)板，每孔加入20μL MTT(0.5g/L)，孵化4h，吸去原液，加入150μL DMSO，置免疫酶標儀570nm 處測定吸光度，細胞生存率以百分率表示。按如下公式計算：

細胞生存率（%）=處理組A值/對照組A值×100%

1.2.5 乳酸脫氫酶（LDH）的釋放

將制備好的細胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板：分為空白組（細胞對照組）及不同濃度劑量的實驗處理組，每組培養(yǎng)24h后，取細胞培養(yǎng)上清液于2000r/min室溫離心3min，于全自動生化分析儀上測定漏出細胞外的LDH活性。

1.2.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 L929細胞培養(yǎng)

在倒置的相差顯微鏡下觀察L929細胞系的生長情況，發(fā)現(xiàn)細胞呈梭形和多角形貼壁生長，具有典型的成纖維細胞的形態(tài)特征。細胞生長旺盛，約1d傳代一次，細胞活力很強（圖1）。

圖1 光學顯微鏡下L929細胞形態(tài)（×100）

2.2 不同濃度銀杏內(nèi)酯藥物銀杏內(nèi)酯納米粒和空白納米粒對L929細胞株生存率的影響

不同濃度銀杏內(nèi)酯藥物、銀杏內(nèi)酯納米粒和空白納米粒對L929細胞株的毒性采用MTT法判定，結(jié)果以細胞的存活率表示（均值±標準差）。在2、4和7d時間點測定各濃度劑量的銀杏內(nèi)酯藥物、銀杏內(nèi)酯納米粒和空白納米粒對L929細胞生長抑制作用是采用析因設計資料方差分析方法。析因方差分析結(jié)果顯示銀杏內(nèi)酯藥物各劑量組間差異不具有顯著性（F= 1.590，P= 0.203）。各測量時間點間差異具有顯著性（F= 67.653，P= 0.000）。對細胞生長抑制作用顯著減弱，與高劑量組（10和5g/L劑量）相比差異極顯著（P＜0.01）。在4d，5g/L劑量處理組與低劑量（1和0.5g/L劑量）相比，差異不顯著（P＞0.05）。而10g/L劑量組與低劑量組差異顯著（P＜0.05）。在7d，高劑量組（10和5g/L）對L929細胞生長仍有一定的抑制作用，與低劑量組相比差異極顯著（P＜0.01）。在相同的測定時間點，細胞的生存率隨著銀杏內(nèi)酯納米粒劑量的減少而增高。相同濃度的銀杏內(nèi)酯納米粒對細胞的影響隨著細胞培養(yǎng)天數(shù)的增多而減少，組內(nèi)差異均不顯著（P＞0.05）。

2.3 不同濃度銀杏內(nèi)酯藥物、銀杏內(nèi)酯納米粒和空白納米粒處理后L929細胞株LDH活性

經(jīng)不同濃度（100、75和50g/L）的銀杏內(nèi)酯藥物、銀杏內(nèi)酯納米粒和空白納米粒處理后，L929細胞株培養(yǎng)液中LDH活性與空白對照組比較均有所升高，但差異不具顯著性（P＞0.05）（表1～表3）。提示各劑量組的上述3種藥物對L929細胞株均無明顯的細胞毒性。

3 討 論

銀杏內(nèi)酯是一類有效的血小板活化因子受體拮抗劑，是治療心腦血管疾病的常用藥物[3-5]。當前市場上提供的銀杏藥物制劑有口服和靜脈給藥2種劑型，銀杏內(nèi)酯銀杏的主要活性成分之一，其溶解吸收差，生物利用度不高，而且傳統(tǒng)給藥方式全身分布，靶器官和靶細胞血藥濃度低，達不到很好的治療效果[5,6]。為此，我們根據(jù)銀杏藥物內(nèi)酯的作用機制，選擇合適的靶向性藥物載體研制出銀杏內(nèi)酯納米粒，可將銀杏內(nèi)酯有效成分靶向?qū)肽X內(nèi)。 通過銀杏內(nèi)酯納米粒的細胞毒性研究，為進一步驗證其在腦內(nèi)的分布、代謝、半衰期、生物效應奠定基礎。研究結(jié)果顯示，銀杏內(nèi)酯納米粒與其藥物對照銀杏內(nèi)酯及載體對照空白納米粒相比，細胞毒性無統(tǒng)計學意義，其細胞毒性僅為Ⅰ級，說明研制的銀杏內(nèi)酯納米粒生物相容性好，可以進一步研究其藥效及藥理作用，提示銀杏內(nèi)酯納米粒研制獲得了初步的成功。

[1]Olivier JC,Fenart L,Chauvet R,et al.Indirect evidence that drug brain targeting using polysorbate-80 coated polybutylcyanoacrylate nanoparticles is related to toxicity[J].Pharm.Res,1999,16(12):1836.

[2]Haun JB,Devaraj NK,Hilderbrand SA,et al.Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection[J].Nat Nanotechnol,2010 Aug 1. [Epub ahead of print].

[3]Li LY,Zhao XL,Fei XF,et al.Bilobalide inhibits 6-OHDA-induced activation of NF-kappaB and loss of dopaminergic neurons in rat substantia nigra.[J].Acta Pharmacol Sin,2008,29(5):539-547.

[4]楊本明,劉紅.銀杏葉制劑臨床應用新進展[J].中華醫(yī)學研究與實踐,2005,3(1):44-45.

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