毛文文 田偉盟 陳國強(qiáng) 周 寧

1 昆明市第二人民醫(yī)院老年科（650204）

2 昆明市延安醫(yī)院內(nèi)分泌科（650051）

陜西省第四人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科（710043）

內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）亦稱內(nèi)皮前體細(xì)胞，是指能分化增殖為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的一群祖細(xì)胞。目前，EPCs 介導(dǎo)的血管再生及損傷血管修復(fù)已經(jīng)成為糖尿病、心血管疾病、腫瘤等疾病中的研究熱點(diǎn)。2型糖尿病中微血管損傷及血小板活化機(jī)制的揭示正受到許多學(xué)者的關(guān)注。本研究觀察2型糖尿病患者EPCs與CD62P改變，探討其在糖尿病發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

檢測用的外周血標(biāo)本采自30例糖尿病患者（DM）及10例糖耐量正常的健康對(duì)照者。30例糖尿病患者包括測定10例血糖控制良好（HbA1c＜7%）T2DM患者（A組）、10例血糖控制中等（HbA1c7%～11%）T2DM患者（B組）、10例血糖控制較差（HbA1c＞11%）T2DM患者（C組）。

1.2 EPCs的檢測

1.2.1 細(xì)胞表面標(biāo)志

采用CD45-Cy5，CD133-RPE等標(biāo)記。內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）：CD133+/CD45。

1.2.2 檢測方法

采用熒光抗體標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測。抽取外周血3mL抗凝，血標(biāo)本用PBS液2倍稀釋，F(xiàn)icoll分離，1800r/min離心20min，PBS洗2次。將細(xì)胞加入96 孔板中，每孔5×105個(gè)細(xì)胞，加入抗體5μL，4℃孵育30～60min，用PBS液洗滌標(biāo)本2次，100μL的1 %多聚甲醛固定，流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 CD62P的檢測

試驗(yàn)組及對(duì)照組測定血小板及其參數(shù)均使用EDTA-K2抗凝管抽靜脈血2mL送檢，采血后均在2h內(nèi)進(jìn)行測定。使用儀器為日本Sysmex公司生產(chǎn)的XE22100型血細(xì)胞分析儀，所用檢測試劑均為原裝配套試劑。血液分析所用的EDTA-K2抗凝試管為美國BD公司提供的真空采血管，血小板CD62P測定采用美國BD公司FACS Calibur型流式細(xì)胞儀及配套試劑并嚴(yán)格按儀器要求操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有資料使用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)比較應(yīng)用兩組均數(shù)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以Spearman相關(guān)系數(shù)評(píng)價(jià)變量間相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 DM與對(duì)照組患者外周血EPCs、CD62P水平值變化

EPCs在初診T2DM組顯著低于健康對(duì)照組；血小板CD62P表達(dá)陽性程度在2型糖尿病患者中顯著高于對(duì)照組（P＜0.01） ，見表1。

表1 糖尿病組患者外周血中EPCs 、CD62P水平變化（%）

2.2 不同病變程度DM患者外周血EPCs 、CD62P水平值變化

C組EPCs水平明顯低于B組及A組，C組與B組有差異（P＜0.05）；C組與A組有差異（P＜0.01）；B組低于A組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；C 組CD62P的水平顯著高于B組及A組（P＜0.05，P＜0.01），B組與A組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 不同病變程度DM患者（按糖化血紅蛋白分組）外周血CD62P、EPCs水平變化（%）

2.3 T2DM患者外周血中CD62P、 EPCs相關(guān)性分析

相關(guān)性顯示，EPCs與CD62P（r= -0.564，P＜0.01）呈負(fù)相關(guān)；EPCs與FPG（r= -0.341，P＜0.05）呈負(fù)相關(guān)；CD62P與FPG（r= 0.443，P＜0.01）呈正相關(guān)。鑒于資料有限未行多因素分析。

3 討 論

糖尿病為一種慢性代謝性疾病，除葡萄糖、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)代謝紊亂外尚有凝血纖溶系統(tǒng)功能的紊亂，可導(dǎo)致各種并發(fā)癥尤其是血管并發(fā)癥的出現(xiàn)[1-10]。有報(bào)道認(rèn)為患者的高凝血活性與并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，其凝血活性與患者病情的控制情況的好壞相關(guān)[8]。

CD62P又稱血小板α顆粒膜蛋白140（granule membrane protein-140，GMP-140），是血小板內(nèi)α顆粒的成分，當(dāng)血小板被激活后可表達(dá)于血小板表面，是血小板活化的分子標(biāo)志物。2型糖尿病患者由于在疾病過程中存在血管內(nèi)皮細(xì)胞受損、脂質(zhì)過氧化等原因可導(dǎo)致血小板激活，患者的高血糖狀態(tài)本身也可導(dǎo)致血小板活化，血小板被激活后其凝血活性增高，表現(xiàn)在聚集功能增強(qiáng)、細(xì)胞表面α-顆粒膜蛋白表達(dá)量增多等[1-6]。目前有關(guān)內(nèi)皮祖細(xì)胞與血小板活化因素研究較少[8-10]。

本研究中探討內(nèi)皮祖細(xì)胞及CD62P的變化，發(fā)現(xiàn)糖尿病患者內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)目減少而血小板CD62P的陽性表達(dá)程度增高，二者間存在一定的相關(guān)性。內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)目減少說明2型糖尿病患者體內(nèi)存在血管損傷[9]。CD62P陽性表達(dá)程度增高可反映2型糖尿病患者體內(nèi)存在著血小板的活化及消耗的情況，說明2型糖尿病患者處于高凝狀態(tài)[7-10]。血管內(nèi)皮損傷和血小板激活在糖尿病患者的病情發(fā)展、并發(fā)癥的發(fā)生方面起一定的作用，對(duì)糖尿病患者進(jìn)行抗血小板功能藥物的治療可能有助于糖尿病病情的控制并可預(yù)防其血栓性并發(fā)癥的發(fā)生。但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

[1]Avogaro A,Fadini GP,Gallo A,et al.Endothelial dysfunction in type 2 diabetes mellitus[J].Nutr Metab Cardiovasc Dis,2006,16(S1):39-45.

[2]Wong CY,Qiuwaxi J,Chen H,et al.Daily intake of thiamine correlates with the circulating level of endothe lial progenitor cells and the endothelial function in patients with type II diabetes[J].Mol Nutr Food Res,2008,52(12):1421-1427.

[3]Brunner S,Schernthaner GH,Satler M,et al.Correlation of different circulating endothelial progenitor cells to stages of diabetic retinopathy:first in vivo data[J].Invest Ophthalmol Vis Sci, 2009,50(1):392-398.

[4]Luk TH,Dai YL,Siu CW,Habitual physical activity is associated with endothelial function and endothelial progenitor cells in patients with stable coronary artery disease[J].Eur J Cardiovasc Prev Rehabil,2009,16(4):464-471.

[5]Kusuyama T,Omura T,Nishiya D.Effects of treatment for diabetes mellitus on circulating vascular progenitor cells[J].J Pharmacol Sci,2006,102(1):96-102.

[6]Tepper OM,Galiano RD,Capla JM,Human endothelial progenitor cells from type II diabetics exhibit impaired proliferation,adhesion,and incorporation into vascular structures[J].Circulation,2002,106(22):2781-2786.

[7]Fadini GP,Miorin M,Facco M.Circulating endothelial progenitor cells are reduced in peripheral vascular complications of type 2 diabetes mellitus[J].J Am Coll Cardiol,2005,45(9):1449-1457.

[8]Martin Fontecha A,Baumjohann D,Guarda G,et al.CD40L+CD4+memory T cells migrate in a CD62P-dependent fashion into reactive lymph nodes and license dendritic cells for T cell priming[J].J Exp Med,2008,205(11):2561-2574.

[9]Sambuceti G,Morbelli S,et al.Diabetes impairs the vascular recruitment of normal stem cells by oxidant damage,reversed by increases in pAMPK,heme oxygenase-1,and adiponectin[J].Stem Cells,2009,27(2):399-407.

[10]Mohler ER,Shi Y,Moore J,et al.Diabetes reduces bone marrow and circulating porcine endothelial progenitor cells,an effect ameliorated by atorvastatin and independent of cholesterol[J].Cytometry A,2009,75(1):75-82.