卜麗梅,關(guān)鳳英,喬 萍,于艷華,趙麗紅,石 卓*

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院干部病房,吉林長(zhǎng)春130021;2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系,吉林長(zhǎng)春130021)

心肌缺血-再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)是指心肌經(jīng)受較長(zhǎng)時(shí)間缺血后得到血液灌注,此時(shí)并不能減輕缺血損傷,而是加重了損傷,甚至將可逆性損傷轉(zhuǎn)為不可逆性損傷,MIRI過(guò)程中,細(xì)胞凋亡有著重要的病理意義[1-2]。一旦心肌細(xì)胞受損啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序,可導(dǎo)致心肌細(xì)胞數(shù)目減少和心功能的降低,加重MIRI。藥物預(yù)處理對(duì)缺血再灌注損傷心肌的保護(hù)成為目前的研究熱點(diǎn)之一[3]。我國(guó)具有悠久的中醫(yī)中藥歷史,中草藥資源豐富,開(kāi)發(fā)前景廣闊。沒(méi)食子酸(gallic acid,GA),化學(xué)名3,4,5-三羥基苯甲酸,是可水解鞣質(zhì)的組成部分,廣泛存在于葡萄,茶葉等植物中,是自然界存在的一種多酚類(lèi)化合物來(lái)源于蓼科植物掌葉大黃根莖、桃金娘科植物大葉桉干燥葉、山茱萸科植物山茱萸的果實(shí)、千屈菜科植物千屈菜的花、馬桑科植物馬桑葉、石榴科植物石榴果皮等。已有文獻(xiàn)證實(shí)GA具有抗炎、抗突變、抗氧化等多種生物學(xué)活性,本實(shí)驗(yàn)旨在以抗細(xì)胞凋亡為切入點(diǎn),探討GA預(yù)處理對(duì)MIRI造成的細(xì)胞凋亡的影響及其可能存在的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物、主要試劑及儀器Wistar大鼠,清潔級(jí),體重200-250 g,由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。沒(méi)食子酸(gallic acid,GA)由預(yù)防醫(yī)學(xué)院化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供,純度大于95%。丹參注射液。LDH、CPK、AST測(cè)定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供;GF-200半自動(dòng)生化測(cè)定儀(山東高密彩虹儀器有限公司);

1.2動(dòng)物模型制備大鼠冠脈結(jié)扎及再灌模型按文獻(xiàn)方法稍加改進(jìn)[4],在20%烏拉坦麻醉下,將大鼠仰位固定于手術(shù)臺(tái)上,頸部正中分離氣管行氣管插管,開(kāi)胸后接呼吸機(jī)。小動(dòng)物呼吸機(jī)設(shè)定潮氣量為09、呼吸頻率為66-76次/min,吸呼比為1∶2,根據(jù)呼吸頻率及深度調(diào)整呼吸參數(shù)。自左側(cè)3-4肋間開(kāi)胸,暴露心臟,于肺動(dòng)脈圓錐及左心耳間找出冠脈左前降支,除假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎外,其余各組均以0號(hào)線立即結(jié)扎冠脈,打活結(jié),將心臟送回胸腔。心電圖顯示S-T段抬高,并且T波與QRS波融合為結(jié)扎成功,各組動(dòng)物在結(jié)扎40 min后,迅速打開(kāi)結(jié)扎線進(jìn)行再灌注,再灌注120 min。

1.3實(shí)驗(yàn)分組和給藥實(shí)驗(yàn)分組:wistar大鼠32只,隨機(jī)分為四組,每組8只。假手術(shù)組,只開(kāi)胸穿線,不結(jié)扎LAD;缺血再灌注組(模型組),結(jié)扎LAD 40 min,再灌注120 min,于結(jié)扎前10 min舌下靜脈注射0.9%氯化鈉溶液;丹參組(DS),舌下靜脈注射丹參注射液100 mg·kg-1,余同模型組;沒(méi)食子酸組(GA),灌胃給沒(méi)食子酸 20 mg·kg-1,余同模型組。

1.4大鼠血清心肌三酶活性測(cè)定肌酸磷酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)含量的測(cè)定:實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,腹主動(dòng)脈取血,3 000 r/min離心10 min取血清。按試劑盒說(shuō)明書(shū)比色法測(cè)定CK、LDH、AST含量。

1.5記錄大鼠不同時(shí)間點(diǎn)心電圖的變化心電圖ST段的測(cè)量大鼠固定后,于四肢皮下插入針形電極連接上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司的ECG-6511型心電圖機(jī)。連續(xù)心電監(jiān)測(cè),并依次描記結(jié)扎前、缺血5、40 min和再灌注 10 min、120 min 時(shí) Ⅱ?qū)?lián)心電圖(紙速50 mm/s,增益1 mV=10 mm)。標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖的變化。

1.6心肌梗死范圍(MIS)的測(cè)定每組動(dòng)物剖取心臟,用預(yù)冷的生理鹽水漂洗,除去血液及脂肪組織,用濾紙拭干,稱(chēng)全心及心室濕重。將心室心肌橫切6片,然后浸入N-BT磷酸緩沖液中,置37℃恒溫水浴,待染色完全后取出,正常組織染色,缺血組織不染色。切下梗死心肌稱(chēng)重,用梗死心肌與全心濕重的百分比計(jì)算MIS。

1.7心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)TUNEL染色按試劑盒提供的脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)原位檢測(cè)凋亡細(xì)胞的DNA碎片。各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,取心尖部位心肌常規(guī)脫水固定,石蠟包埋,切片,從各組取5張石蠟切片,二甲苯脫蠟,梯度乙醇脫水,PBS(pH7.2)沖洗(每次5 min,共 3 次,下同);蛋白酶K(20 μ g/ml)37℃消化 30 min,PBS沖洗;3%H2O2室溫下處理5 min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性,PBS沖洗,含0.1%TritonX-100的0.1%枸櫞酸溶液以去除細(xì)胞膜表面污物,(冰上4 min),PBS沖洗;加 50 μ l TUNEL反應(yīng)混合液,包括脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶液,37℃孵育60 min,PBS沖洗,加POD液37℃孵育30 min,PBS沖洗,DAB顯色。在400×顯微鏡下,于缺血區(qū)邊緣隨機(jī)采集5個(gè)非重疊視野,檢測(cè)100個(gè)心肌細(xì)胞中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),取其平均值。凋亡陽(yáng)性率以單位面積內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)百分比表示。

1.8免疫組化法測(cè)定大鼠心肌Bax、Bcl-2的表達(dá)取心尖缺血梗死區(qū)橫切2 mm厚心肌,以PBS配成10%甲醛溶液固定,以免疫組化SP法觀察心肌細(xì)胞iNOS表達(dá)。操作步驟如下:(1)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水;(2)3%H2O2常溫下孵育10 min以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性,蒸餾水沖洗,PBS浸洗5 min;(3)加山羊血清封閉液,室溫15 min清除背景非特異性染色;(4)滴加兔抗鼠Bax、Bcl-2抗體37℃孵育1h;(5)滴加生物素標(biāo)記羊抗兔IgG,37℃孵育30 min;(6)加辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素,37℃孵育30 min;(7)上述(3)(4)(5)后均以 PBS洗3 min×3次;(8)DAB顯色,自來(lái)水充分沖洗,蘇木素復(fù)染,封片。陰性對(duì)照以PBS代替一抗進(jìn)行孵育,其他步驟同上。陽(yáng)性反應(yīng):細(xì)胞漿呈棕褐色為Bax、Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)。Image-pro軟件分析計(jì)算各組陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的光密度值。

2 結(jié)果

2.1GA對(duì)大鼠血清CK、LDH及AST的影響大鼠缺血40 min,再灌120 min后,取血測(cè)定血清CPK、LDH及AST活性。結(jié)果與假手術(shù)比較,再灌注模型組血清CPK、LDH及AST活性明顯升高(P＜0.01),與再灌注模型組相比,GA能降低血清CK、LDH及AST三酶的活性(P＜0.05或P＜0.01),見(jiàn)表1。

2.2GA對(duì)缺血-再灌注大鼠心電圖的影響缺血-再灌注使實(shí)驗(yàn)各組部分大鼠心臟出現(xiàn)室性心律失常,所有大鼠均有ST段抬高,其中假手術(shù)組變化不明顯,模型組及DS組、GA組與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),表明結(jié)扎及再灌均引起心肌缺血損傷;模型組與DS組、GA組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),表明DS、GA對(duì)心肌缺血有一定的緩解作用,見(jiàn)表2。

表1 GA對(duì)大鼠血清CK、LDH及AST的影響(n=8,s)

與假手術(shù)組比較,#P＜0.01;與模型組比較,*P＜0.05

分組 CK(U/L)LDH(U/L)AST(U/L)假手術(shù)組 328.12±159.4 330.3±64.2 104.4±40.6模型組 1230.4±213.5# 1193.0±223.1# 436.0±106.4#DS 886.3±97.8#* 894.25±280.3#*294.7±67.5#*GA 880.9±161.0#* 797.7±320.9#*304.8±72.4#*

表2 GA對(duì)心肌缺血再灌注大鼠心電圖 ST段的影響(n=8,s)

表2 GA對(duì)心肌缺血再灌注大鼠心電圖 ST段的影響(n=8,s)

與假手術(shù)組比較aP＜0.01;與模型組比較bP＜0.05

分組 結(jié)扎前 結(jié)扎后5 min 結(jié)扎后40 min 再灌后10 min 再灌后120 min假手術(shù)組 1.0±0.1 1.2±0.2 1.0±0.3 1.1±0.3 1.0±0.2模型組 1.1±0.2 6.3±1.1a 7.5±0.7a 7.9±1.0a 8.2±0.4a DS 1.1±0.1 5.3±0.9a 6.7±0.3ab 7.3±0.8a 7.4±0.6ab QKL 1.0±0.15 5.2±0.7ab 6.6±0.4ab 6.8±0.5ab 6.6±0.3ab

2.3GA對(duì)心肌損傷范圍及凋亡率的影響大鼠缺血40 min再灌120 min,取心肌染色,以損傷心肌占全心濕重的百分比來(lái)計(jì)算MIS。與假手術(shù)組比較,再灌注模型組MIS明顯的大面積損傷(P＜0.01),表明大鼠心肌缺血再灌注模型建立成功。與再灌注模型組相比,DS組及GA組均能明顯縮小MIS(P＜0.05或 P＜0.01),見(jiàn)表3。

TUNEL染色結(jié)果表明凋亡陽(yáng)性細(xì)胞呈深棕色,細(xì)胞核萎縮,染色質(zhì)聚邊,胞漿不著色。SH組存在少量凋亡細(xì)胞,I/R組可見(jiàn)大量凋亡細(xì)胞,與SH組比較差異具有顯著性(P＜0.001);GA組和DS組凋亡細(xì)胞百分率低于模型組,差異具有顯著性(P＜0.05)。見(jiàn)圖1和表3。

Fig.1 GA對(duì)實(shí)驗(yàn)性缺血再灌注損傷大鼠心肌TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的影響(400×)

表3 GA對(duì)心肌損傷面積(%)和細(xì)胞凋亡率的影響(s,n=6)

表3 GA對(duì)心肌損傷面積(%)和細(xì)胞凋亡率的影響(s,n=6)

###P＜0.001,compared with SH group;*P＜0.05,compared with I/R group;⊿P＜0.05 compared with AS(5 g·kg-1)group

分組 動(dòng)物數(shù)(只)損傷面積(%)凋亡率(%)假手術(shù)組 8 0 2.0±0.2模型組 8 42.30±2.5# 17.3±1.8###DS 8 32.16±3.8#* 11.9±2.2*GA 8 33.05±5.2#* 16.7±2.5⊿

2.4GA對(duì)Bax、Bcl-2的影響B(tài)ax、Bcl-2在胞漿中成片表達(dá),呈棕黃色。在假手術(shù)組Bax、Bcl-2均有表達(dá),但量較小,Bax與Bcl-2相近。與假手術(shù)組比較,缺血再灌模型組Bax、Bcl-2表達(dá)均明顯增高。與模型組比較,GA組Bax蛋白含量顯著減少,Bcl-2蛋白含量顯著增多。GA具有抗大鼠心肌缺血再灌注損傷作用,其機(jī)制可能通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax比值介導(dǎo)心肌缺血再灌注細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)。(圖2、3)

圖2 GA對(duì)促凋亡蛋白Bax表達(dá)的影響

圖3 GA對(duì)抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)的影響

3 討論

MIRI過(guò)程中細(xì)胞凋亡有著重要的病理意義,病理學(xué)認(rèn)為,細(xì)胞凋亡機(jī)制與心肌短暫缺血后再灌注損傷密切相關(guān)[5]。姚震等[6]研究表明,不同時(shí)間的心肌缺血再灌注損傷均可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡,以缺血30-60 min后再灌注時(shí)明顯,說(shuō)明心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生率與此前心肌缺血時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。再灌注損傷引起的細(xì)胞凋亡多分布于短暫缺血后血管再通的相關(guān)部位和梗死灶的收縮帶區(qū)域。

本研究觀察到,與假手術(shù)組比較,模型組心肌三酶的漏出量增加,心肌梗死面積和細(xì)胞凋亡率提高。預(yù)先給予GA可明顯減輕心肌三酶的漏出量、心肌梗死面積明顯縮小,細(xì)胞凋亡率顯著降低,說(shuō)明GA對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠心肌缺血-灌注損傷后細(xì)胞凋亡具有明顯的保護(hù)作用。

表4 GA對(duì)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響(n=8,s)

表4 GA對(duì)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響(n=8,s)

而與假手術(shù)組比較#P＜0.01,與模型組比較*P＜0.01

分組 劑量 Bcl-2 Bax bcl-2/bax假手術(shù)組 —— 38.24±4.38 38.24±4.38 1.03±0.2模型組 —— 96.23±12.10#* 96.23±12.10#* 0.36±0.041 DS 100mg·kg-1 75.38±10.28#* 75.38±10.28#* 1.26±0.342 GA 20mg·kg-1 74.41±9.56#* 74.41±9.56#* 3.51±0.372

細(xì)胞凋亡與某些凋亡相關(guān)基因表達(dá)及調(diào)控有關(guān),其中,細(xì)胞凋亡由細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因直接控制,bax基因與bcl-2基因具有高度的同源序列,bcl-2和bax是兩個(gè)重要的相關(guān)基因,前者抑制細(xì)胞凋亡,而后者促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7]。Bax蛋白與Bcl-2蛋白可相互結(jié)合形成結(jié)合體,過(guò)度表達(dá)Bax蛋白可促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制 Bcl-2的抗凋亡作用。因此,Bax和Bcl-2表達(dá)的比例決定細(xì)胞是生存還是凋亡[8-9]。GA組大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2表達(dá)顯著增高,而B(niǎo)ax蛋白顯著降低,Bax/Bcl-2顯著下降,細(xì)胞陽(yáng)性染色面積百分率顯著降低,提示GA可能通過(guò)調(diào)控Bax/Bcl-2的比值抑制I/R心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡,減輕I/R損傷。

Bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制除bax本身具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用外,還可通過(guò)①bax與bcl-2形成異源二聚體,抑制bcl-2的作用,并可抑制bcl-2家族中bcl-xL等基因的抑制凋亡作用;②bax/bax形成同源二聚體,抑制線粒體細(xì)胞色素C的釋放,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,缺血再灌注使bcl-2和bax的表達(dá)明顯增多,但以bax的增多更為顯著,使bcl-2/bax值顯著降低,細(xì)胞凋亡明顯。而給予GA治療組bcl-2表達(dá)增加,bax表達(dá)下降,bcl-2/bax值升高,心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少。由此推測(cè),GA抑制心肌細(xì)胞凋亡可能是其縮小梗死面積、保護(hù)心肌的機(jī)制之一,而抑制心肌缺血再灌注引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與下調(diào)bax和上調(diào)bcl-2的蛋白表達(dá),提高bcl-2/bax比值有一定關(guān)系,直接證據(jù)有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

[1]ElsasserA,VogtAM,Nef H,et al.Humanhibernatingmyocardium is jeopardized by apoptotic and autophagic cell death[J].J Am Coll Cardiol,2004,43(12):2191.

[2]Katori M,Buelow R,Key B,et al.Heine oxygenase-1 overexpression protects rat hearts from cold ischemia/reperfusion injury via an anti apoptotion pathway[J].Transplantation,2002,72(2):287.

[3]N.P.Riksen,P.Smits,G.A.Rongen.Ischaemic preconditioning:from molecular characterisation to clinical application-part II.Neth J Med.2004;62(11):409.

[4]湯 東,王 英,朱永澤.心肌損傷動(dòng)物模型的建立及應(yīng)用.解剖與臨床.2004;9(2):126-127.

[5]馬桂蘭.細(xì)胞凋亡與冠心病[J].醫(yī)學(xué)綜述,2000,6(11):491.

[6]姚震,焦解歌,馮建章.心肌缺血再灌注損傷與細(xì)胞凋亡關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2000,6(3):129.

[7]Melo G,Agranal R,Zhang L,et al.Gene therapy strategy for longterm myocardialprotection using adeno-associated virus-mediated delivery ofhemeoxygenase gene[J].Circulation,2002,105(2):602.

[8]Xie Z,Koyama T,Suzuki J,et al.Coronary reperfusion following ischemia:different expression of bcl-2 and bax proteins,and cardiomyocyte apoptosis[J].JpnHeart J,2001,42(6):759.

[9]McClintock DS,SantoreMT,LeeVY,et al.Bcl-2 familymembers and functional electron transport chain regulate oxygen deprivation-induced cell death[J].MolCellBio,l 2002,22(1):94.

[10]BorutaiteV,BudriunaiteA,MorkunieneR,et al.Release of mitochondrial cytochrome C and activation of cytosolic caspases induced bymyocardial ischemia[J].Biochimica Biophysica Acta,2001,1537(11):101.