董 雪,史艷芬,呂 慧,范洪學(xué),李榮貴*

(1.吉林大學(xué)病理生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林長(zhǎng)春130021;2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院;3.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué))

飲水型地砷病是由于長(zhǎng)期攝入過(guò)量砷而引起的一種慢性蓄積性中毒性疾病,在世界范圍內(nèi)廣范存在,已成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的公害病,其中大部分分布在亞洲國(guó)家,中國(guó)正是受砷中毒危害最為嚴(yán)重的國(guó)家之一[1,2]。亞砷酸鈉是飲水型地砷病中砷化物存在的主要形式,其常見(jiàn)臨床表現(xiàn)以肢端中小血管循環(huán)障礙及皮膚損傷為主,嚴(yán)重的患者甚至?xí)饜盒阅[瘤[3]。病理上以末梢血管退行性變及肢端壞死為主要改變。飲水型地砷病目前引起血管損傷的機(jī)制不清,本研究擬用雞胚絨毛尿囊膜血管新生模型和人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,研究砷對(duì)血管增殖效應(yīng)的體內(nèi)體外作用,以期為地砷病的血管損傷機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料、儀器

亞砷酸鈉(NaAsO2),購(gòu)于SIGMA公司;HUV-EC(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)由吉林大學(xué)第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng),(Dulbecco’s Modified Eagle Media,DMEM)培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司;優(yōu)級(jí)胎牛血清購(gòu)自北京元亨金馬生物公司;LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;Trizol試劑盒、RT2PCR試劑盒購(gòu)自Takara公司;2×SYBR GreenⅠ試劑購(gòu)自ABI公司。Real time2PCR儀為美國(guó)ABI7300。受精種蛋購(gòu)于龍德養(yǎng)雞場(chǎng),每只55-65 g。

2 方法

2.1CAM模型的建立

CAM造模參考文獻(xiàn)方法[4]進(jìn)行改良。雞胚 50只,在37℃、5%CO2及50%的相對(duì)濕度下孵化。

2.2向CAM加藥

用打孔機(jī)將玻璃纖維濾紙制成直徑3 mm的小圓片,濕熱滅菌。 設(shè) 6 個(gè)給藥組(0.033、0.33、3.3、0.1、1、10 μ mol/L)并設(shè)PBS陰性對(duì)照組。雞胚孵化3天后照蛋檢查血管網(wǎng)生長(zhǎng)情況,剔除未發(fā)育的種蛋,每組5只。在超凈臺(tái)內(nèi),將種蛋表面用酒精消毒后,用鑷子在蛋胚頂端小心戳一小口,然后剝?nèi)ブ車(chē)牡皻ず蜌つ?使開(kāi)口約為1.5 cm×1.5 cm大小。小心地用尖手術(shù)鑷子從氣室與卵黃囊分隔處挑破氣室膜,輕輕去除上層氣室薄膜,暴露下層的CAM 膜。將吸附10μ l藥物或等量PBS的載樣濾紙置于CAM和卵黃囊膜處血管較少的部位,然后用滅菌透明膠封口,繼續(xù)孵育24 h。觀察,計(jì)數(shù)藥膜周?chē)? mm內(nèi)血管數(shù),并攝影記錄。

2.3細(xì)胞培養(yǎng)HUV-EC培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.4HUV-EC增殖的檢測(cè)取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,以5×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板,100μ l/孔,加入不同濃度亞砷酸鈉(如圖2所示),作用 24小時(shí)后,每孔加入 CCK-8液10 μ l,置于37℃、5%CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1小時(shí),室溫下低速振蕩5 min,靜置10分鐘,酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定吸光度,重復(fù)3次,計(jì)算抑制率。

2.5總RNA提取及RT-PCR分別按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū),應(yīng)用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(具體操作步驟均按廠家產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行),其反應(yīng)條 件為:30℃、10 min,42℃、30 min,99℃、5 min,5℃、5 min。c-myc、c-jun采用實(shí)時(shí)定量 RT-PCR(SYBR Green法)進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)?50℃2分鐘;95℃10分鐘;92℃10秒,60℃30秒,共50個(gè)循環(huán)。引物由上海生工生物工程公司合成,引物序列見(jiàn)表1所示。

表1 實(shí)時(shí)PCR引物序列

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示,P＜0.05有顯著差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1NaAsO2對(duì)CAM血管生長(zhǎng)的影響在低于1 μ mol/L濃度范圍內(nèi),肉眼觀察可見(jiàn)隨亞砷酸鈉濃度增加,與對(duì)照組(0 μ mol/L)相比給藥組載體下,血管明顯生長(zhǎng),可見(jiàn)尿囊膜血管排列成車(chē)輻狀,類(lèi)似樹(shù)葉的葉脈狀分布,在 0.33 μ umol/L時(shí)即有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(如圖 B所示);在高于1 μ mol/L濃度范圍內(nèi)。隨著亞砷酸鈉濃度增加,血管結(jié)構(gòu)破壞,或血管雖有一定數(shù)量,但其結(jié)構(gòu)并未形成熟血管的圓形狀態(tài),在部分給藥載體旁,沒(méi)有血管區(qū)域,當(dāng)濃度達(dá)到10μ mol/L(如圖E所示),給藥載體旁形成血管池,雞胚的發(fā)育明顯抑制,部分雞胚死亡,與對(duì)照組相比有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。

圖1 亞砷酸鈉對(duì)CAM的作用

表2 不同濃度NaAsO2對(duì)CAM血管生長(zhǎng)的影響

3.2NaAsO2對(duì)HUV-EC增殖的抑制作用HUV-EC經(jīng)過(guò)不同濃度的亞砷酸鈉溶液孵育24小時(shí)后,用CCK-8試劑盒檢測(cè)活細(xì)胞數(shù),分析亞砷酸鈉對(duì)細(xì)胞抑制的影響。結(jié)果顯示:亞砷酸鈉對(duì)HUV-EC作用24 h時(shí),30、40 μ mol/L實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)與0 μ mol/L對(duì)照組相比有差異性(P＜0.05);50 μ mol/L以上的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)與相應(yīng)對(duì)照組相比均有顯著性差異(P＜0.01);其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率隨亞砷酸鈉濃度的增加而增大,有劑量-效應(yīng)關(guān)系如圖2所示。

圖2 亞砷酸鈉對(duì)HUV-EC的抑制作用

3.3NaAsO2降低HUV-EC的c-myc、c-junmRNA 應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)對(duì)HUV-ECmRNA表達(dá)水平的分析,結(jié)果顯示:經(jīng)20μ mol/L濃度亞砷酸鈉處理的HUV-EC,其 c-myc、c-jun的mRNA表達(dá)水平明顯降低。結(jié)果如圖3所示:經(jīng)過(guò)20 μ mol/L亞砷酸鈉溶液處理后,HUVECs的增殖基因mRNA表達(dá)量與對(duì)照組細(xì)胞相比分別下降了69%和19%,統(tǒng)計(jì)學(xué)上均有顯著性差異(**P＜0.01)。

圖3 亞砷酸鈉降低HUV-EC的c-myc、c-jun mRNA水平

4 討論

地砷病的發(fā)病機(jī)制目前并不十分清楚,在其疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,常見(jiàn)以末梢血管退行性變及肢端壞死為主要改變。雞胚尿囊膜(CAM)血管新生模型是常用的體內(nèi)血管研究模型。在Nicole V.Soucy等人研究基礎(chǔ)上[5],本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了3.3μ mol/L濃度的亞砷酸鈉對(duì)血管即有明顯的抑制作用(P＜0.05),當(dāng)濃度達(dá)到 10 μ mol/L時(shí),給藥載體周?chē)研纬裳艹?部分雞胚甚至死亡。本研究中又以HUV-EC為體外研究模型,研究砷對(duì)其作用。我們?cè)谳^早的研究中就發(fā)現(xiàn)亞砷酸鈉可以通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,這在其對(duì)血管損傷進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示亞砷酸鈉在30 μ mol/L時(shí),就明顯抑制HUV-EC的增殖,在所用的亞砷酸鈉濃度范圍內(nèi)呈典型的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

c-myc、c-jun是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白,它與其蛋白配基(主要是Max蛋白)形成復(fù)合物后轉(zhuǎn)移并定位于胞核內(nèi),與DNA特異性的序列相結(jié)合,參與調(diào)節(jié)Cyclin、CDKs等細(xì)胞周期關(guān)鍵蛋白的表達(dá)[7],進(jìn)而影響細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和細(xì)胞周期。提示本實(shí)驗(yàn)結(jié)果:亞砷酸鈉抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,是通過(guò)下調(diào)c-myc[8]、c-jun基因的表達(dá),進(jìn)而降低細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的含量,影響細(xì)胞周期實(shí)現(xiàn)的。

隨著亞砷酸鈉濃度增加,CAM血管增生明顯受到抑制,HUV-EC增殖抑制率明顯升高,且 c-myc、c-jun基因表達(dá)量下降,說(shuō)明砷化物是通過(guò)下調(diào)c-myc、c-jun表達(dá)來(lái)抑制血管增殖。在飲水型地砷病中內(nèi)皮細(xì)胞的增殖在維持血管完整性、血管損傷的修復(fù)過(guò)程中起到重要作用,而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)亞砷酸鈉對(duì)體內(nèi)血管及體外HUV-EC增殖均有抑制作用,從而提示:在地砷病的發(fā)病過(guò)程中,NaAsO2對(duì)血管增殖抑制是其致病機(jī)制之一。

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