秦歡歡,王學(xué)鋒,許冠群,陸曄玲,丁秋蘭,戴 菁,奚曉東,王鴻利

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院、上海血液學(xué)研究所;醫(yī)學(xué)基因組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海200025;2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院臨床輸血科)

血小板無(wú)力癥是由于血小板糖蛋白IIb(GPIIb)或者IIIa(GPIIIa)的基因缺陷導(dǎo)致血小板對(duì)多種誘導(dǎo)劑(如腺苷二磷酸、膠原、花生四烯酸、腎上腺素)先天性、遺傳性反應(yīng)減低甚至無(wú)反應(yīng)。本病為一種常染色體隱性遺傳的血小板功能障礙性疾病。血小板無(wú)力癥根據(jù)GPIIb/IIIa復(fù)合物量的減少或者質(zhì)的異常分為3型:Ⅰ型GT(IIb/IIIa＜5%)占大多數(shù)(78%)。Ⅱ型GT(IIb/IIIa占5%-25%)約占14%。Ⅲ型GT(IIb/IIIa)又稱(chēng)變異型GT約占40%-100%。目前關(guān)于GT基因缺陷報(bào)道包括基因點(diǎn)突變、缺失、插入、重排,絕大多數(shù)為點(diǎn)突變。本研究中對(duì)3例血小板無(wú)力癥家系進(jìn)行臨床診斷和家系調(diào)查共發(fā)現(xiàn)6種純合性基因突變,其中先證者3基因純合性插入及多位點(diǎn)突變?yōu)閲?guó)際首次報(bào)道。

1 對(duì)象與方法

1.1 家系資料

家系1:先證者,女,14歲。出生后3-4天就有皮膚出血點(diǎn)、口腔牙齦出血。12歲初潮,月經(jīng)量多持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。其母有鼻出血,但月經(jīng)量不多。其父無(wú)出血史。家系圖見(jiàn)圖1a。

家系2:先證者,女,14歲。出生后10個(gè)月開(kāi)始鼻出血,感冒后會(huì)自發(fā)性鼻出血、牙齦出血。皮膚可見(jiàn)明顯出血點(diǎn)。其外公及爺爺有出血病史。家系圖見(jiàn)圖1b。

家系3:先證者,女,12歲。自幼有牙齦出血、鼻出血、耳出血、咽出血及皮膚瘀斑,家族無(wú)類(lèi)似出血病史。家系圖見(jiàn)圖1c。

以上3個(gè)家系先證者均為漢族,父母為近親婚配。

圖1 三個(gè)遺傳性血小板無(wú)力癥家系圖

1.2 方法

1.2.1篩選試驗(yàn) 血小板計(jì)數(shù)及模板法檢測(cè)出血時(shí)間(BT),全血涂片觀察血小板的形態(tài)和分布。

1.2.2確診實(shí)驗(yàn) 二磷酸腺苷(ADP)、腎上腺素、花生四烯酸、膠原和瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集試驗(yàn)(PAgT)及全血法流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)檢測(cè)血小板表面CD41(αⅡb)和CD61(β3)表達(dá)。

1.2.3排除實(shí)驗(yàn) 通過(guò)檢測(cè)常規(guī)凝血項(xiàng)目包括活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶時(shí)間(TT)及纖維蛋白原(Fg)含量排除凝血障礙性疾病,通過(guò)檢測(cè)血管性血友病因子抗原(vWF:Ag)及其活性(vWF:A)以排除血管性血友病(von Willebrand’s disease,vWD)。

1.2.4αⅡb及β3基因分析 采集先證者及家系成員外周血2.7 ml,1∶9枸櫞酸鈉抗凝,立即4℃、3 000 r/min離心15 min收集上層血漿。利用北京天根生物公司DNA抽提試劑盒抽提先證者及其家系成員外周血基因組DNA。引物序列及反應(yīng)體系條件見(jiàn)參考文獻(xiàn)[1,2]。先擴(kuò)增先證者αⅡb及β3基因各外顯子及側(cè)翼序列,PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠純化后,用末端標(biāo)記雙脫氧法標(biāo)記后測(cè)序(美國(guó)ABI公司DNA測(cè)序儀ABI3130XL),用Chromas軟件將測(cè)序結(jié)果與美國(guó)NCBI基因庫(kù)所公布的序列進(jìn)行比對(duì),3次正反測(cè)序證實(shí)。家系成員DNA僅在先證者αⅡb及β3基因突變區(qū)域擴(kuò)增、純化后測(cè)序,以確定突變基因的存在及突變類(lèi)型。同時(shí)針對(duì)新的突變位點(diǎn),通過(guò)檢索單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)及對(duì)100名健康人中進(jìn)行相應(yīng)區(qū)域的PCR擴(kuò)增、純化后DNA直接測(cè)序的方法進(jìn)行多態(tài)性篩查。通過(guò)查詢(xún)ISTH數(shù)據(jù)庫(kù)(http://sinaicentra1.mssm.edu/intranet/research/glanzmann)及相關(guān)文獻(xiàn)查詢(xún)證實(shí)新突變。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果

2.1.1血涂片3個(gè)先證者全血涂片觀察血小板形態(tài)正常,多散在分布、不聚集,血小板計(jì)數(shù)均正常。出血時(shí)間均延長(zhǎng)。

2.1.2PAgT 3個(gè)先證者對(duì)二磷酸腺苷(ADP)、腎上腺素、花生四烯酸、膠原等生理性誘聚劑反應(yīng)低下或者無(wú)反應(yīng),而對(duì)瑞斯托霉素的反應(yīng)基本正常。全血流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)3例先證者血小板膜表面αⅡβ3表達(dá)明顯減少甚至缺如。

2.1.33個(gè)先證者及其家系成員的凝血四項(xiàng)檢查(包括APTT、PT、TT、Fg)及vWF:Ag 及vWF:A 均基本正常。家系成員檢測(cè)結(jié)果略。(見(jiàn)表1)。

2.1.4αⅡ及β3基因分析

3個(gè)先證者αⅡb基因30個(gè)外顯子及側(cè)翼序列及β3基因15個(gè)外顯子及側(cè)翼序列通過(guò)Chromas軟件分析,αⅡb及β3基因分別與Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中(GI:195546903)及(GI:195546904)比對(duì),共發(fā)現(xiàn)6種純合突變均位于αⅡb基因上(見(jiàn)表2)。先證者1在αⅡb基因的17號(hào)外顯子存在14502C＞T純合性突變,其母親具有與其相同的C＞T雜合性改變。先證者2在αⅡb基因26號(hào)外顯子存在18859C＞T純合性突變,其父親、母親、弟弟及其他部分家系成員具有與其相同的雜合性突變。先證者3在αⅡb基因的15號(hào)外顯子第14103-5 14104位核苷酸之間發(fā)生純合性插入T(14103-14104insT),同時(shí)又發(fā)生3個(gè)點(diǎn)突變14105A＞C、14106G＞C、14107A＞T導(dǎo)致編碼GPIIb蛋白的第418-483位氨基酸發(fā)生移碼突變。其父親、母親、奶奶及曾外婆具有與其相同的雜合性插入及3個(gè)雜合性點(diǎn)突變(圖2)。

表1 3例GT家系先證者實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果

表2 3例GT家系先證者基因檢測(cè)結(jié)果

圖2 3個(gè)先證者及部分家系成員測(cè)序圖

3 討論

整合素αⅡbβ3是血小板膜上表達(dá)最豐富的一種糖蛋白,當(dāng)血小板處于活化狀態(tài)時(shí),可以結(jié)合纖維蛋白原、血管性血友病因子(vWF)及纖維連接蛋白等多種黏附分子,在血小板黏附聚集過(guò)程中起關(guān)鍵作用。整合素αⅡbβ3是一種鈣離子依賴(lài)性異二聚體,在鈣離子參與下以1∶1比例構(gòu)成復(fù)合物,αⅡb或者β3任一亞基發(fā)生突變都會(huì)影響復(fù)合物的形成及細(xì)胞表面的表達(dá),從而導(dǎo)致血小板無(wú)力癥。

本研究中3例先證者父母均為近親婚配,先證者自幼就反復(fù)出現(xiàn)皮膚瘀斑、瘀點(diǎn),鼻出血及牙齦出血,臨床表型診斷血涂片可見(jiàn)形態(tài)正常的血小板分散存在無(wú)聚集,血小板計(jì)數(shù)正常,出血時(shí)間明顯延長(zhǎng),凝血象正常,血小板對(duì)多種生理性誘導(dǎo)劑反應(yīng)低下或者缺無(wú),而對(duì)瑞斯托霉素反應(yīng)正?；蛘呓咏！Ａ魇郊?xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)αⅡb及β3含量比正常人明顯減低,確診為GT。由于GT是一種常染色體隱性遺傳病,雜合子通常不發(fā)病,本研究中的3個(gè)先證者均為純合性基因突變,父母均為該位點(diǎn)的雜合性基因突變。3例先證者的父母臨床上均無(wú)出血表現(xiàn)。

家系1先證者在αⅡb基因的17號(hào)外顯子存在14502位存在C→T的純合基因突變,導(dǎo)致553位氨基酸由精氨酸(R)變?yōu)榻K止密碼子(stop),母親為該位點(diǎn)的雜合性突變,父母為近親婚配,推測(cè)其父親也應(yīng)為該位點(diǎn)的雜合性突變。該位點(diǎn)突變是引起GT的熱點(diǎn)突變,包括本研究中家系1在內(nèi)已在10例GT患者中有報(bào)道,其中8例無(wú)血緣關(guān)系[3-6]。該突變發(fā)生在17號(hào)外顯子的3’端剪切位點(diǎn)附近,有文獻(xiàn)報(bào)道此突變可以激活17號(hào)外顯子內(nèi)潛在剪切位點(diǎn),導(dǎo)致17號(hào)外顯子末端75 bp的缺失,導(dǎo)致相應(yīng)的25個(gè)氨基酸的缺失[6]。

家系2先證者在αⅡb基因的26號(hào)外顯子存在18859位存在C→T的純合基因突變,導(dǎo)致860位氨基酸由谷氨酰胺(Q)變?yōu)榻K止密碼子(stop),父母親為該位點(diǎn)的雜合性突變,本研究小組于2008年1月及2009年3月兩次報(bào)道過(guò)該位點(diǎn)的雜合性突變[7,8],提示該位點(diǎn)也是引起I型GT的熱點(diǎn)突變。本研究小組曾在2007年做過(guò)該突變位點(diǎn)的體外表達(dá)試驗(yàn),共轉(zhuǎn)染αⅡb Q860stop突變質(zhì)粒及野生型質(zhì)粒β3的293T細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后收獲細(xì)胞,Western blot顯示其細(xì)胞內(nèi)GPIIb蛋白含量與共轉(zhuǎn)朵野生型αⅡb及P3質(zhì)粒的細(xì)胞明顯差異,但蛋白分子量明顯降低,提示終止密碼的提前出現(xiàn),造成了蛋白翻譯的提前終止,產(chǎn)生了截?cái)嗟鞍譡8]。之前也有報(bào)道發(fā)生在26號(hào)外顯子純合突變870位絲氨酸(Ser)突變?yōu)榻K止密碼子,該突變導(dǎo)致αⅡb的穿膜區(qū)及胞質(zhì)區(qū)的缺失,產(chǎn)生截?cái)嗟鞍啄芘cβ3亞基在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中形成復(fù)合物,但不能進(jìn)行翻譯后加工,導(dǎo)致不能成熟表達(dá)于血小板表面[9],導(dǎo)致GT發(fā)生。

家系3先證者在αⅡb基因的15號(hào)外顯子靠近3’端14103與14104位之間純合性插入T,導(dǎo)致移碼突變,同時(shí)其后的3個(gè)核苷酸又發(fā)生純合性點(diǎn)突變,分別為14105A＞C、14106G＞C、14107A＞T,其父母、奶奶及曾外婆均為與其相同的雜合性插入突變及雜合性點(diǎn)突變,可見(jiàn)這個(gè)插入突變與之后的3個(gè)點(diǎn)突變位于同一條染色體上。此插入性突變之后又引起的多個(gè)位點(diǎn)的點(diǎn)突變目前國(guó)際上尚未有類(lèi)似報(bào)道[10]。筆者推測(cè)可能由于插入堿基T后引起血小板糖蛋白IIb結(jié)構(gòu)變化,蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定導(dǎo)致之后多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生點(diǎn)突變。先證者的父母為近親婚配,父母均具有與先證者相同的雜合突變。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示αⅡb及β3均降低至1%左右,推測(cè)此插入突變及多個(gè)位點(diǎn)的點(diǎn)突變可能改變?chǔ)立騜糖蛋白空間結(jié)構(gòu),影響αⅡbβ3復(fù)合物的形成,導(dǎo)致 I性GT發(fā)生[11,12]。關(guān)于此多個(gè)位點(diǎn)復(fù)合突變對(duì)αⅡbβ3復(fù)合物合成轉(zhuǎn)運(yùn)及功能的影響需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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