王金河,孫海林,李洪敏,吳雪瓊,梁建琴,馮士生,孫 靜

(1.解放軍第309醫(yī)院結(jié)研所結(jié)核二科,北京100091;2.鄂爾多斯二院結(jié)核科;3.朝陽(yáng)區(qū)疾病預(yù)防控制中心,吉林長(zhǎng)春130021)

當(dāng)前,結(jié)核病在世界范圍內(nèi)疫情回升,迄今仍然是危害人類健康的主要傳染病。結(jié)核病已成為傳染病中的第一號(hào)殺手和最大的死亡病因之一。為探索結(jié)核病控制的新途徑,利用BACTEC MGIT 960儀器分析動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭饕K器的結(jié)核分枝桿菌(MT)生長(zhǎng)情況,觀察MT的MPT64、ESAT6質(zhì)粒DNA疫苗預(yù)防結(jié)核病的效力。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/C小鼠由北京藥檢所動(dòng)物中心提供。

1.1.2MT強(qiáng)毒株(H37RV)由中國(guó)藥品生物制品鑒定所提供。

1.1.3質(zhì)粒 JW4303-MPT64和JW4303-ESAT 6重組表達(dá)質(zhì)粒、宿主菌大腸桿菌DH5a由本院研究室提供,卡介苗由成都生物制品研究所提供。

1.2BACTEC MGIT 960全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)儀及其相關(guān)試劑由美國(guó)BD提供。

1.3方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)分組 6～8周齡雌性的 BALB/C小鼠38只,購(gòu)于北京藥檢所動(dòng)物中心,分為五組。A組6只,雙側(cè)脛前肌各注射生理鹽水0.1 ml;B組6只,緩慢注射50 μ g/50 μ l載體質(zhì)粒;C 組6只,注射卡介苗 0.1 ml;D 組 10 只 ,緩慢注射 50 μ g/50 μ l重組質(zhì)粒JW4303-MPT64 DNA;E組10只,注射重組質(zhì)粒JW4303-ESAT6 DNA(方法同D組)除C組外,其他四組分別于0、3、6周各免疫3次。

1.3.2H37RV MT強(qiáng)毒株(5X106 CFU/ML)攻擊小鼠。在9周時(shí)每只注射0.5 ml于小鼠腹腔內(nèi)。攻擊一個(gè)月后,將每組前3只小鼠殺死。用75%乙醇浸泡小鼠20分鐘,開腹取出肺、肝、脾。用無(wú)菌生理鹽水沖洗,然后放入組織研磨器內(nèi)研磨。取研磨好的組織懸液0.1 ml加入到0.9 ml生理鹽水中混勻,取0.5 ml接種于BACTEC MGIT 7H9培養(yǎng)管中,加入0.8 ml添加劑,放入BACTEC MGIT 960培養(yǎng)儀內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。各組剩余的小鼠被攻擊兩個(gè)月后,將其全部殺死,重復(fù)上述操作步驟,用BACTEC MGIT 960培養(yǎng)儀進(jìn)行培養(yǎng)。每日觀察培養(yǎng)結(jié)果,若為陰性結(jié)果需培養(yǎng)42天。

1.3.3淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 取小鼠脾研磨好的組織懸液,加入淋巴細(xì)胞分離液,離心后,吸取淋巴細(xì)胞層,與適度PHA混合,置37℃培養(yǎng)72小時(shí)。取培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞進(jìn)行涂片、染色、鏡檢。根據(jù)細(xì)胞大小、核與胞質(zhì)的比例、胞質(zhì)的染色性質(zhì)和核結(jié)構(gòu)以及有無(wú)核仁等情況,分別計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞(包栝大淋巴細(xì)胞、過(guò)渡型母細(xì)胞、核絲分裂相細(xì)胞)和小淋巴細(xì)胞,以百分率報(bào)之。

1.3.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 在進(jìn)行淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)時(shí),采用對(duì)比試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)方法。采用的統(tǒng)計(jì)量為

其中n1.表示A組的觀察細(xì)胞數(shù)。n11表示轉(zhuǎn)化的細(xì)胞數(shù),n12表示未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞數(shù)。n2.表示C組的細(xì)胞觀察數(shù)。n21表示細(xì)胞轉(zhuǎn)化數(shù),n22表示未轉(zhuǎn)化數(shù).K的分布近似地遵從分布。

2 結(jié)果

MT H37RV強(qiáng)毒株攻擊一個(gè)月的小鼠肺、脾、肝培養(yǎng)結(jié)果,樣本最快檢出時(shí)間為6天,90%陽(yáng)性樣本檢出時(shí)間為7-13天,最遲檢出時(shí)間為40天,41-42天均無(wú)陽(yáng)性樣本檢出。小鼠肺、脾、肝用BACTEC—960培養(yǎng)的每天GI(生長(zhǎng)指數(shù))平均值分別見圖1。A、B、C、D、E組的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(%)平均值分別為 54.2%;52.7%;53.8%;60.5%;56.3%。其中D、E組轉(zhuǎn)化率明顯高于B組。攻擊二個(gè)月的小鼠肺、脾、肝的培養(yǎng)結(jié)果,樣本最快檢出時(shí)間為5天,90%陽(yáng)性樣本檢出時(shí)間為10-15天,最遲檢出時(shí)間為30天,31-42天均無(wú)陽(yáng)性樣本檢出。小鼠肺、脾、肝用BACTEC 960培養(yǎng)的每天GI平均值分別見圖2。A、B、C、D、E組的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(%)平均值分別為46%;46.6%;54%;63%;59.83%。其中C、D、E組明顯高于B。

一、二個(gè)月生長(zhǎng)指數(shù)(GI)值的比較(見圖3)其中,肺和肝數(shù)值明顯降低,差異顯箸(P＜0.05)。小鼠脾的數(shù)值無(wú)明顯變化。

在淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(%)試驗(yàn)中,第二個(gè)月的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率平均值明顯高于第一個(gè)月(見表1),以D組為最高。

圖1 一個(gè)月MT生長(zhǎng)指數(shù)

圖2 二個(gè)月MT生長(zhǎng)指數(shù)

圖3 MT攻擊小鼠一,二月肺的比較

表1 各組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)對(duì)比

3 討論

國(guó)際研究已證明了結(jié)核病的DNA免疫可表達(dá)和傳遞蛋白抗原,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答,對(duì)分枝桿菌產(chǎn)生保護(hù)性免疫[2、3、4],而國(guó)內(nèi)尚無(wú)報(bào)導(dǎo)。為探索結(jié)核病控制的新途徑,利用BACTEC MGIT 960全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)儀進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头治鯷1],以觀察MT的MPT64、ESAT6質(zhì)粒DNA疫苗的保護(hù)效力。

分枝桿菌的抗原既有共同抗原又有種的特異性抗原,其抗原總數(shù)多達(dá)100種以上。保護(hù)性抗原是種特異性抗原的決定簇,還是共同抗原的決定簇,或者二者兼?zhèn)渖性谘芯恐?。在MT的免疫應(yīng)答中,哪一種抗原占主導(dǎo)地位、起主要作用就必須借助動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)行細(xì)致的研究。DNA疫苗的作用原理是使外源基因在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá),表達(dá)的蛋白抗原和MHCⅠ類分子結(jié)合后,被送到細(xì)胞表面,再被CD8+T淋巴細(xì)胞的受體識(shí)別而誘發(fā)CTL的細(xì)胞毒反應(yīng),這對(duì)細(xì)胞內(nèi)寄生的分枝桿菌有很大的殺傷作用。MPT64、ESAT6質(zhì)粒DNA都是分枝桿菌復(fù)合群主要的分泌性蛋白質(zhì),也是其重要的T細(xì)胞抗原。本研究將上述二種DNA疫苗免疫小鼠,借以觀察小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答,并通過(guò)試驗(yàn)評(píng)價(jià)這二種DNA疫苗的保護(hù)作用。

利用BACTEC 960全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)儀進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭饕K器的MT生長(zhǎng)情況,研究資料顯示上述二種DNA疫苗在小動(dòng)物試驗(yàn)的預(yù)防過(guò)程中是有效力的(見表1)。DNA組細(xì)菌計(jì)數(shù)下降率比載體對(duì)照組(B)明顯。第二個(gè)月比第一個(gè)月培養(yǎng)時(shí)間明顯向后推遲且集中。同時(shí),第二個(gè)月曲峰強(qiáng)度也比第一個(gè)月明顯減弱,可能說(shuō)明小鼠經(jīng)DNA疫苗刺激后,免疫力增強(qiáng),使MT生長(zhǎng)受抑制和生長(zhǎng)速度減慢的原故。據(jù)Kamath報(bào)道[2]用呼吸道氣霧攻擊小鼠4周時(shí),MPT64DNA疫苗可使肺部MT菌落數(shù)比載體對(duì)照減少0.38log10,與本試驗(yàn)相同,但試驗(yàn)中也反應(yīng)出小鼠個(gè)體生長(zhǎng)指數(shù)差異明顯,從各組間分析,除A組之外,其它各組小鼠肺和肝GI值均有不同程度的下降,以D組最明顯,淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率也證明了這一點(diǎn)。說(shuō)明D組的重組質(zhì)粒JW4303-MPT64保護(hù)力優(yōu)于E組ESAT6質(zhì)粒DNA疫苗的保護(hù)效力。C組卡介苗第一個(gè)月預(yù)防效力比第二個(gè)月強(qiáng),證明卡介苗保護(hù)效力好,但隨時(shí)間的延長(zhǎng),此作用開始減弱。小鼠脾的計(jì)數(shù)無(wú)規(guī)律,可能與之對(duì)MT不敏感有關(guān)?？傊?與B組比,小鼠免疫力的短期預(yù)防是有所增強(qiáng),其中卡介苗前期效果明顯;MPT64、ESAT6是持續(xù)效果好。

[1]Black GF,Weir RE,Floyd S,et al.BCG-induced increase in interferongamma response to mycobacterial antigens and efficacy of BCG vaccination in Malawi and the UK:two randomised controlled studies[J].Lancet,2002,35:1393.

[2]Brandt L,Feino Cunha J,Weinreich Olsen A,et al.Failure of the Mycobacterium bovis BCG vaccine:some species of environmental mycobacteria block multiplication of BCG and induction of protective immunity to tuberculosis[J].Infect Immun,2002,70:672.

[3]Cole ST,Brosch R,Parkhill J,et al.Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence[J].Nature,1998,39:537.

[4]Glickman MS,Jacobs WR Jr.Microbial pathogenesis of Myco bacterium tuberculosis:dawn of a discipline[J].Cell,2001,104:477.

[5]Kamath AT,Feng CG,Macdonald M,et al.Differential protective efficacy of DNA Vaccines expressing secreted proteins of Mycobacterium teberculosis[J].Infect Immun,1999,67:1702.

[6]Pym AS,Brodin P,Brosch R,et al.Loss of RD1 contributed to the attenuation of the live tuberculosis vaccinesMycobacterium bovis BCG and Mycobacterium microti[J].Mol Microbiol,2002,46:709.