趙 巖,林風(fēng)武,李 才,王麗娟,巴麗薇

(1.吉林大學(xué)第二臨床醫(yī)院內(nèi)分泌科,吉林長(zhǎng)春130041;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院胸外科;3.吉林大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)藥理與毒理學(xué)教研室)

尾加壓素Ⅱ(UⅡ)是新近發(fā)現(xiàn)的一種在生物界廣泛存在的生長(zhǎng)抑素樣環(huán)狀結(jié)構(gòu)神經(jīng)肽,是一種自分泌/旁分泌生長(zhǎng)因子。研究發(fā)現(xiàn),UⅡ?qū)δI小球系膜細(xì)胞(MC)具有促絲裂作用[1],可能在糖尿病腎病(DN)發(fā)病機(jī)制中具有一定作用。本實(shí)驗(yàn)觀察了UⅡ?qū)w外高糖培養(yǎng)的MC纖連蛋白(FN)、IV型膠原(Col IV)mRNA表達(dá)的影響,旨在為進(jìn)一步探討UⅡ在DN發(fā)病中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠腎小球系膜細(xì)胞系購(gòu)自上海坤肯生物化工有限公司;尾加壓素Ⅱ購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;山羊抗大鼠UⅡ多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司;PCR引物由上海生工生物技術(shù)公司合成;英國(guó)Techne TC-312 PCR擴(kuò)增儀;德國(guó)Hermle/2K38離心機(jī)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和干預(yù) 選用傳代至5-10代生長(zhǎng)良好的MC,經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化,制成單個(gè)細(xì)胞懸液,以每孔1×104的細(xì)胞數(shù)接種于12孔培養(yǎng)板中。當(dāng)生長(zhǎng)至覆蓋瓶底面積70%時(shí),更換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液,培養(yǎng)24 h后按下述干預(yù)條件進(jìn)行分組:①對(duì)照組;②UⅡ組:終濃度10-8mol/L;③UⅡ+Ca2+通道阻斷藥尼卡地平組(尼卡地平,10-5mol/L,提前5 min加入);④UⅡ+Ca2+螯合劑 EDTA組(EDTA 2×10-3mol/L,提前30 min加入);⑤UⅡ+UⅡ抗體組(抗UⅡ抗體10-5mol/L,提前60 min加入)。每孔設(shè)6個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)24 h。

1.2.2RT-PCR檢測(cè)FN、ColⅣmRNA表達(dá)水平

1.2.2.1細(xì)胞總RNA提取及RNA純度測(cè)定 上述各組細(xì)胞棄上清,PBS沖洗后加入Trizol提取細(xì)胞總RNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)260 nm/280 nm處紫外吸收值,重復(fù)三次取平均值。結(jié)果各組A260/A280在1.8-2.0之間,說(shuō)明所提取RNA純度高。

1.2.2.2逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 采用30 μ l反應(yīng)體系。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3引物合成 根據(jù)基因庫(kù)檢索大鼠FN、ColⅣ及內(nèi)參對(duì)照物GAPDH mRNA序列,應(yīng)用引物設(shè)計(jì) 軟件設(shè)計(jì)引物,由上海生工生物技術(shù)公司合成。

Primer sequences for PCR products

1.2.2.4聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)采用25 μ l反應(yīng)體系,退火溫度因引物不同而不同,30個(gè)循環(huán)后,72℃延伸10 min,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.5PCR產(chǎn)物的檢測(cè)和分析 各泳道以PCR產(chǎn)物:上樣緩沖液為5∶1(μ l)上樣,恒壓85 V 電泳。電泳結(jié)果在紫外燈下照相,用Tanon GIS-1000凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

與對(duì)照組比較,UⅡ組MC FN、ColⅣmRNA表達(dá)明顯升高(P＜0.05);UⅡ+尼卡地平組、UⅡ+EDTA組及UⅡ+抗UⅡ抗體組MC FN、ColⅣmRNA表達(dá)明顯低于UⅡ組(P＜0.05),UⅡ+抗UⅡ抗體組最為明顯,比對(duì)照組稍高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見(jiàn)表 1、圖 1。

表1 UⅡ?qū)?MC FN、ColⅣmRNA表達(dá)的影響

3 討論

DN的早期病理改變?yōu)槟I小球肥大、增生和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)積聚。MC是腎小球的主要固有細(xì)胞,是ECM合成的主要場(chǎng)所,FN和Col IV是ECM的主要成分,反映ECM的代謝水平[2]。

圖1 UⅡ?qū)Υ笫驧C FN、ColⅣmRNA表達(dá)的影響

Watamabe等[3]研究發(fā)現(xiàn),UⅡ能以自分泌/旁分泌方式作用于MC,對(duì)MC具有促增殖作用。大量體內(nèi)外研究證實(shí),系膜細(xì)胞增生與ECM增多之間有密切聯(lián)系,二者在 DN發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用[4-6]。但UⅡ與ECM間關(guān)系目前還不清楚。

目前認(rèn)為,UⅡ與其特異性受體GPR14結(jié)合,引起Ca2+內(nèi)流,細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高,是引發(fā)其生物學(xué)作用的根本原因[7]。我們以10-8mol/LUⅡ[8]作為試驗(yàn)組,以UⅡ+Ca2+通道阻斷劑尼卡地平、UⅡ+Ca2+螯合劑EDTA及UⅡ+抗UⅡ抗體作為UⅡ作用阻斷組,觀察了各組MC FN、ColⅣmRNA表達(dá)情況。結(jié)果顯示,UⅡ組MC FN、ColⅣmRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高(P＜0.05),說(shuō)明UⅡ能增加MC FN、ColⅣmRNA表達(dá)。各UⅡ阻斷組MC FN、ColⅣmRNA表達(dá)水平明顯低于UⅡ組(P＜0.05),且與對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),說(shuō)明這種促M(fèi)C FN、ColⅣmRNA表達(dá)作用是UⅡ所特異的,且與Ca2+有關(guān)。這是UII直接作用還是間接作用的結(jié)果,還有待于進(jìn)一步探討。這一結(jié)果可能成為UⅡ參與DN發(fā)生發(fā)展的又一實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]張勇剛,陳亞紅,馬春艷,等.尾加壓素Ⅱ的促絲裂作用[J].中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志,2001,9(1):14.

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[3]Watamabe T,Pakala R,Katagiri T,et al.Synergistic effect of urotensinⅡwith mildly oxidired LDL on DNA synthesis in vascular smooth muscle cells[J].Circulation,2001,104:16.

[4]Sharma K,Ziyadeh FN.The emerging role of transforming growth factorβin kidney diseases[J].Am J Physiol,1994,35:829.

[5]Mason RM,Wahab NA.Extracellular matrix metabolism in diabetic nephropathy[J].Am Soc Nephrol,2003,14:1358.

[6]Fogo AB.Glomerular Hypertension,abnormal glomerular growth,and progression of renal diseases[J].Kidney Int,2000,75:S15.

[7]Ames RS,Sarau HM,Chambers JK,et al.Human urotensinⅡis a potent vasoconstrictor and agonist for the orphan receptor GPR14[J].Nature,1999,401:282.

[8]趙 巖,李 才,林風(fēng)武,等.尾加壓素II對(duì)體外高糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2008,34(6):954-958.