董宇靜 張玉英

1.廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院；2.廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，廣東 廣州 510006

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 色譜條件的選擇

本組實(shí)驗(yàn)采用LC-1OATvp液相色譜儀：日本島津。N2010色譜工作站（中國(guó)科學(xué)院生產(chǎn)）。微型旋渦振蕩器（WH-1）。離心機(jī)（80-2）。除甲醇為色譜純外，其余均為分析純?cè)噭?。C18色譜柱，5μm，250×4.6mmi.d；柱溫：35℃；流動(dòng)相：甲醇：5mmol/L Tris緩沖溶液（pH4.5，5：95，V/V）；紫外可見(jiàn)檢測(cè)器，根據(jù)全波長(zhǎng)掃描結(jié)果確定檢測(cè)波長(zhǎng)310nm。

表1 批內(nèi)精密度試驗(yàn)（mg/ml）

1.2 對(duì)照品與樣品溶液的制備

精密稱(chēng)取香豆素對(duì)照品0.010g，于100mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為母液，精密吸取母液2mL于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，后經(jīng)0.45μL濾膜過(guò)濾，得濾液即為對(duì)照品溶液。然后準(zhǔn)確稱(chēng)取曬干粉碎后的黑香豆粉末各1.0g，加80%乙醇50mL，常溫下，超聲波提取1h，冷卻后過(guò)濾，共提取2次，合并濾液，濾液減壓濃縮至干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。準(zhǔn)確吸取2mL，于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，經(jīng)0.45μL濾膜過(guò)濾，得濾液即為供試樣品。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

取香豆素母液，分別準(zhǔn)確吸取1.0，4.0，8.0mL于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。準(zhǔn)確吸取上述溶液各20μL，在相應(yīng)的色譜條件下進(jìn)行分析。得線(xiàn)性回歸方程：Y=38.125X-7.164，r=0.9968。結(jié)果表明香豆素在50-50μg/mL呈良好線(xiàn)性關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 柱溫的選擇

固定其他條件，控制色譜柱溫分別為20℃，25℃，30℃，35℃，40℃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)色譜柱溫為30℃時(shí)，香豆素的色譜峰發(fā)生拖尾或者重疊；柱溫為25℃時(shí)，香豆素的分離度大于1.5、有較好的峰形和響應(yīng)值，故本實(shí)驗(yàn)選擇色譜柱溫為25℃。

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

本組實(shí)驗(yàn)按選定的HPLC色譜條件，在同一天內(nèi)連續(xù)8次測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液，以各組分的峰面積，計(jì)算日內(nèi)精密度（以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD表示）。本法變異系數(shù)為1.02%-1.16%，符合測(cè)定要求的2%以?xún)?nèi)。具體情況見(jiàn)表1。

2.3 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

本組實(shí)驗(yàn)還同時(shí)進(jìn)行了加標(biāo)回收試驗(yàn)。分別加入高、低兩種濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)樣品含量和加標(biāo)后測(cè)定值計(jì)算加標(biāo)回收率，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，香豆素的回收率為102.4%，有較好的回收率。

2.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取黑香豆粉末6份，按2.1項(xiàng)方法制備樣品溶液，后按上述色譜條件進(jìn)行分析，結(jié)果表明重復(fù)性良好，香豆素平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.625%，RSD值為2.25%。

2.5 回收率試驗(yàn)

取1.0g黑香豆粉末按上述方法制備樣品溶液各6份，準(zhǔn)確加入20，30，40μg/mL的香豆素對(duì)照品各10g，進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，每組2份，按上述色譜條件進(jìn)行分析。結(jié)果表明回收率良好，平均回收率為100.50%，RSD為1.50%。

3 討論

高效液相色譜法（HPLC）是發(fā)展較快也較成熟的分析方法，具有高效、高速、高靈敏度及高度自動(dòng)化等特點(diǎn)，尤其適用于高沸點(diǎn)，不能氣化，熱穩(wěn)定性差的有機(jī)物及各種離子的分離分析[1-2]。它是一種非破壞性的技術(shù)手段，可以達(dá)到制備、定性、定量的目的[2-4]。本論文以黑香豆為原料，對(duì)其有效成分香豆素進(jìn)行了提取測(cè)定研究，開(kāi)發(fā)出一條基于高效液相色譜法的黑香豆中香豆素的提取測(cè)量路線(xiàn)，此工藝路線(xiàn)操作簡(jiǎn)便、速度快、安全、無(wú)污染，為進(jìn)一步放大試驗(yàn)及其工業(yè)化生產(chǎn)提供了較為詳盡的技術(shù)方案和試驗(yàn)數(shù)據(jù)。同時(shí)考察了高效液相色譜法定量分析方法，并進(jìn)行其相關(guān)方法學(xué)的研究，結(jié)果令人滿(mǎn)意。

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