馬劍茵，石亞素，童國忠，陶 莉

（1.浙江海洋學(xué)院食品與藥學(xué)學(xué)院、醫(yī)學(xué)院，浙江舟山 316004；2.浙江省舟山市定海區(qū)疾病控制中心，浙江舟山 316000）

隨著抗生素的長期使用，病原菌的耐藥性明顯增強，新的致病菌和病毒不斷出現(xiàn)。因此，有必要從天然產(chǎn)物中尋找新的抗菌藥物資源。海洋生物是一種十分巨大的有待深入開發(fā)的生物資源。目前，已從海洋生物中提取分離得到許多新的生物活性物質(zhì)，其中有些表現(xiàn)出較強的抗菌活性。然而，被篩選的活性物質(zhì)與豐富的海洋資源相比還是微乎其微。

海洋生物的抗菌活性與其生活環(huán)境、生長階段、提取方法等多種因素有關(guān)，因此不同條件下的研究結(jié)果也就有所差異，有關(guān)海洋藻類和貝類生物的提取物對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的抑制作用至今未有統(tǒng)一的結(jié)果。

RAO等[1]的研究結(jié)果表明，海藻提取物對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的抑制作用沒有明顯的差別。CACCAMESE等[2]則報道海藻提取物對革蘭陽性菌的抑制率高于革蘭陰性菌。MITTA等[3]從2種貽貝（Mytilus edulis、Mytilus galloprovincialis）中分離到多種抗菌肽，根據(jù)其一級結(jié)構(gòu)和二硫鍵形成的不同形式可分為4類：防御素、貽貝素、貽貝肽和貽貝霉素，研究發(fā)現(xiàn)均有較強的抗菌活性。范秋領(lǐng)等[4]從隔貽貝、泥螺等醇提物中也發(fā)現(xiàn)有明顯抑制金黃色葡萄球菌的活性成分。

本研究對從舟山海域采集到的泥螺等常見海洋生物進行體外抗菌活性實驗，以期獲得具有一定抗菌活性的物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株

金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus，ATCC-26003；大腸埃希氏菌 Escherichia coli，ATCC-44102；宋內(nèi)氏志賀菌Shigella sonnei，ATCC-51334；鼠傷寒沙門氏菌Salmonella tyhimurium，ATCC-50115；副溶血性弧菌Vibrio parahemolyticus。其中金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、志賀氏痢疾桿菌、鼠傷寒沙門氏菌由中國藥品生物制品檢定所提供，副溶血性弧菌由浙江省質(zhì)控中心提供。

1.1.2 海洋生物

泥螺、毛蚶、青蛤、厚殼貽貝、海帶、紅毛菜、條斑紫菜，均采集于浙江舟山群島海域，由浙江海洋學(xué)院食品與藥學(xué)學(xué)院王斌博士鑒定。

1.1.3 培養(yǎng)基

Mueller-Hinton（MH）瓊脂和Mueller-Hinton（MH）肉湯分別由北京奧博星生物技術(shù)有限公司和美國BBL公司提供。

1.1.4 儀器

CJ-S-I層流潔凈工作臺（上海醫(yī)療器械廠）；SPX-150B-2型生化培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）；DRP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海醫(yī)療器械廠）；麥?zhǔn)媳葷峁埽ū本┨煺\沃德生物技術(shù)有限公司）；DS-1型高速組織搗碎機（上海標(biāo)本模型廠）；TDZ4-WS型離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；JP300型超聲波提取器（武漢嘉鵬電子有限公司）；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 海洋生物提取液的制備

1.2.1.1 水煎液的制備

將泥螺等7種海洋生物洗凈后，置于高速組織搗碎機中勻漿3 min，加100 mL蒸餾水，浸泡2 h后加熱煮沸并不斷攪拌1 h，用高溫消毒的4層紗布趁熱過濾，殘渣同前法再加水煎煮1次。合并2次濾液并加熱濃縮至100 mL，然后將濃縮液離心(5 000 r/min，5 min)。取上清液，用蒸餾水調(diào)至藥材比量為1 g/mL，傾入無菌試管，高壓滅菌后置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 醇提液的制備

將泥螺等7種海洋生物洗凈后，置于高速組織搗碎機中勻漿3 min，加100 mL 40%乙醇溶液，加熱70℃左右回流1 h，用高溫消毒的4層紗布趁熱過濾，將濾液加熱濃縮至100 mL，然后將濃縮液離心(5 000 r/min，5 min)。取上清液，用40%乙醇溶液調(diào)至藥材比量為1 g/mL，傾入無菌試管，高壓滅菌后置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.3 超聲提取液的制備

將泥螺等7種海洋生物洗凈后，置于高速組織搗碎機中勻漿3 min，加100 mL蒸餾水，浸泡2 h后用超聲波提取器70℃左右提取1 h，用高溫消毒的4層紗布趁熱過濾，將濾液加熱濃縮至100 mL，然后將濃縮液離心(5 000 r/min，5 min)。取上清液，用蒸餾水調(diào)至藥材比量為1 g/mL，傾入無菌試管，高壓滅菌后置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌懸液制備[5]

將上述各供試菌種接種到MH瓊脂培養(yǎng)基中，36℃培養(yǎng)18～20 h后用接種環(huán)挑取菌落接種于MH肉湯培養(yǎng)液中。菌液濃度用麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷嵝Ｕ儆没罹嫈?shù)法進行菌落計數(shù)，使含菌量約為1.0×108CFU/mL，備用。

1.2.3 抑菌試驗

1.2.3.1 紙片法初篩抗菌活性

取滅菌過的圓形濾紙片（Φ 6 mm），分別加10 μL樣品（每種樣品的濃度為1 g/mL），于56℃烘箱烘干備用。將5種供試菌液（濃度1.0×108CFU/mL）分別涂布于MH瓊脂平板，稍干后貼上已制備好的各種抗菌活性紙片，同時作空白紙片的對照，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h觀察結(jié)果，測量抑菌圈直徑[6]。

1.2.3.2 最低抑菌濃度（MIC）測定[7]

采用試管倍比稀釋法，分別取無菌試管12支，在第1、2管分別加入各提取液 0.5 mL，在第 2管至第10管分別加人MH 肉湯 0.5 mL，用 1.0 mL分度吸量管從第2管開始管內(nèi)倍比稀釋藥液至第10管，充分混勻后從第 10管中棄去 0.5 mL。第11管加MH肉湯1.5 mL，第 1 管至 10 管分別各加 MH肉湯 1.0 mL，第 12 管加 2.0 mL；第1至11管各加菌懸液0.5 mL。第 11 管不加藥液為陽性對照，第12管只加2.0 mL MH 肉湯為陰性對照。充分混勻放置37℃恒溫箱培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果。結(jié)果判別：如試管內(nèi)呈渾濁，證明有細菌生長；如試管內(nèi)澄清透明，證明無菌生長。以無肉眼可見細菌生長的藥物最低濃度即為該待測菌最低抑菌濃度（MIC）。

表1 紙片法初篩抑菌活性的測定結(jié)果Tab.1 Results of screening for inhibitory activities of 7 marine organisms

2 結(jié)果

7種海洋生物提取液的抗菌活性初篩結(jié)果見表1，MIC的測定結(jié)果見表2。泥螺、條斑紫菜、厚殼貽貝、紅毛菜、毛蚶、海帶對大腸埃希菌、宋內(nèi)氏志賀菌和金黃色葡萄球菌有一定的抑菌作用，其中泥螺、條斑紫菜的超聲提取液和醇提液的抑菌作用尤為明顯。泥螺超聲提取液對副溶血性弧菌和金黃色葡萄球菌的MIC均為62.5 mg/mL，泥螺醇提液對副溶血性弧菌和金黃色葡萄球菌的MIC分別為125 mg/mL和62.5 mg/mL，條斑紫菜醇提液對宋內(nèi)氏志賀菌和金黃色葡萄球菌的MIC分別為62.5 mg/mL和125 mg/mL。青蛤的水煎液、超聲提取液和醇提液對大腸埃希菌、副溶血性弧菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌、金黃色葡萄球菌均無明顯抗菌活性。7種海洋生物的各類提取液對傷寒沙門菌均無抗菌作用。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，舟山群島海域采集到的3種海洋藻類生物，其中紅毛菜和條斑紫菜的抗菌譜較廣，對大腸埃希菌、宋內(nèi)氏志賀菌和金黃色葡萄球菌均有不同程度的抑制作用，尤其以條斑紫菜醇提液對宋內(nèi)氏志賀菌的抑制活性最強。

條斑紫菜中的抗菌活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定尚未見報道，其在藻體中的存在狀態(tài)和性質(zhì)也尚未闡明。江龍法等[8]用一系列不同極性的溶劑對紫菜進行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0～40%范圍內(nèi)時，隨乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高提取物抗菌性增加；繼續(xù)提高乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)，提取物抗菌性降低；當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于60%時，提取物無抗菌能力；乙醚提取物也無抗菌性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，條斑紫菜超聲提取液的抑菌作用較強，分析條斑紫菜中的抗菌物質(zhì)可能存在于細胞內(nèi)，超聲波對提取效果的貢獻可能是通過破壞細胞結(jié)構(gòu)實現(xiàn)的。

貝類的體液免疫因子在機體防御中起著十分重要的作用，貝類的體液免疫因子主要包括水解酶類、凝集素和抗菌肽?？咕氖莿游锩庖叻烙到y(tǒng)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類防御性活性肽類物質(zhì)，能對抗外源性病原體的致病作用，是動物體液防御系統(tǒng)的一個重要組成部分，迄今已有500多種被分離鑒定。在貽貝、菲律賓蛤仔、太平洋牡蠣、泥螺、泥蚶等貝類體內(nèi)均提取到具有一定抗菌活性的肽類物質(zhì)。它們具有一些共同的特點：多數(shù)是富含半胱氨酸的陽離子型分子；分子量一般在10 kDa以下；具有廣譜抗菌活性，且細菌不容易對其產(chǎn)生耐藥性[9]。

本研究結(jié)果表明，泥螺和厚殼貽貝的提取物具有較強的抗菌活性，尤其是泥螺的超聲提取液，對副溶血性弧菌和金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出較強的抗菌活性。本研究工作還顯示，不同來源、不同提取方法所得到的樣本，其抗菌活性有較大區(qū)別。我們將對其進行深入研究，對各種提取液中的抗菌活性物質(zhì)進行進一步的純化和結(jié)構(gòu)分析，希望能從中找到一些新的抗菌化合物，用以進行后續(xù)開發(fā)。

[1]RAO P P S，KAO P S，KARMARKAR S M.Antibacterial substances from brown algae[J].Bot Mar，1986，29:503-507.

[2]CACCAMESE S,TOSCANA R M,FURNARI G,et al.Antimicrobial activities of red and brown algae from Southern Italy Coast[J].Bot Mar,1985,28:505-507.

[3]MITTA G,VANDENBULCKE F,ROCH P.Original involvement of antimicrobial peptides in mussel innate immunity[J].FEBS Lett,2000,486(3):185-190.

[4]范秋領(lǐng),黃才國,繆輝南,等.浙江舟山群島12種海洋動物中生物活性物質(zhì)的初步篩選 [J].中國海洋藥物雜志,2005,24(1):37-39.

[5]馬緒榮,蘇德模.藥品微生物學(xué)檢驗手冊[M].北京:科學(xué)出版社,2000:197-205.

[6]徐叔云,卞如濂,陳 修.藥理實驗方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2003:1 647-1 651.

[7]Clinical and Laboratory standards Institute.Performance standards for Antimicrobial susceptibility testing[M].M100-S15,2005.

[8]江龍法,沈澤峰,錢志剛,等.紫菜中提取抗菌活性物質(zhì)初步探討[J].淮海工學(xué)院學(xué)報:自然科學(xué)版,2007,16(2):59-61.

[9]楊 明,侯 敢,黃迪南,等.海洋貝類體液防御機制的研究進展[J].水產(chǎn)科學(xué),2006,25(8):428-430.