謝寧寧，陳小娥，方旭波，余 輝

（浙江海洋學院食品與藥學院、醫(yī)學院，浙江舟山 316004）

近年來，抗氧化劑在國內(nèi)外發(fā)展很快，用途也越來越廣。1956年HARMAN[1]提出了衰老的自由基理論(free radical theory of aging)之后，越來越多的人認識到人體內(nèi)氧化產(chǎn)生的自由基與人的衰老和許多疾病有關(guān)。因此，許多抗氧化劑被用作功能因子開發(fā)，應用于保健食品及醫(yī)藥等行業(yè)。另外，抗氧化劑能延緩含脂肪食物的腐敗變質(zhì)，它也被運用于食品保鮮儲藏工業(yè)。

抗氧化劑的種類很多，其中已經(jīng)被廣泛使用的多為化學合成類抗氧化劑，由于其具有毒、副作用，各國政府紛紛對其強制規(guī)定了ADI值，控制其添加量[2]。1991年P(guān)ROKORNY[3]提出，一些抗氧化肽和蛋白水解產(chǎn)物能降低自動氧化速率和脂肪的過氧化物含量，之后，尋找和制備高活性的蛋白源抗氧化劑，成為新的研究焦點。

在水產(chǎn)品加工工業(yè)中，不可避免地產(chǎn)生了許多廢棄低值蛋白,采用生物酶工程和發(fā)酵工程等手段，它們可以作為制備抗氧化肽的優(yōu)良備選原料。同時，開發(fā)利用水產(chǎn)副產(chǎn)物中蛋白資源，有利于提高水產(chǎn)品的經(jīng)濟附加值，降低環(huán)境污染。已經(jīng)有許多研究者從多種水產(chǎn)品中制備出具有抗氧化性的活性肽，本文將針對這方面的研究與進展進行綜述。

1 氧化作用的危害及防治

很多證據(jù)顯示，活性氧(ROS)和自由基在許多退行性疾病如癌癥、動脈硬化及糖尿病等中起重要作用[4]，它們的形成是呼吸過程中不可避免的。這些自由基非常地不穩(wěn)定，它們能迅速地同機體中的其它基團或物質(zhì)發(fā)生反應，導致細胞或組織的氧化損傷。生物機體依靠多種由酶系(SOD、GSH-Px、CAT、GST等)和非酶系(葡萄糖、維生素、氨基酸類等)物質(zhì)組成的抗氧化體系，對抗活性氧及自由基。但是，這些防御體系并不能阻止所有氧化損傷。生物體通過補充含有抗氧化物質(zhì)的成分，可以有效地減少氧化損傷對機體的危害。同樣，在食品工業(yè)中，由于脂質(zhì)過氧化，導致食品產(chǎn)生異味、發(fā)臭和潛在的毒性物質(zhì)等不良后果，容易造成不少經(jīng)濟損失[5]。通過在食品中添加抗氧化劑，可以有效地對抗脂質(zhì)過氧化，防止食物腐敗變質(zhì)，避免浪費。

2 水產(chǎn)品抗氧化肽的原料

許多研究者對魚類、甲殼類、軟體動物進行了抗氧化活性的研究。AMAROWICZ和SHAHIDI[6]通過分離毛鱗魚Mallotus villosus蛋白水解液，得到一種在β-胡蘿卜素-亞油酸模型體系內(nèi)具有穩(wěn)定抗氧化活性的組分。SACHINDRA和BHASKAR[7]采用乳酸發(fā)酵蝦Penaeus mondon的廢棄物，制得的產(chǎn)物含有低分子量的蛋白類物質(zhì)，并且其具有清除多種自由基和促滅單線態(tài)氧形成的作用。BINSAN等[8]以不同比例混合的去離子水和乙醇為介質(zhì)，對白蝦Litopenaeus vannamei頭胸部提取出的抗氧化肽的活性和穩(wěn)定性進行了研究。QIAN等[9]通過消化牡蠣Crassostrea gigas蛋白，獲得一種由13個氨基酸殘基組成的抗氧化肽段。

3 水產(chǎn)品抗氧化肽的制備

3.1 制備方法

3.1.1 蛋白酶水解法

通過酶水解蛋白制備抗氧化肽是目前普遍采用的一種方法。酶促水解反應具有條件溫和、易于控制，專一性較強、副反應產(chǎn)物少等優(yōu)點。目前報道中許多水產(chǎn)品抗氧化肽的制備就是采用蛋白酶水解的方法。其中，由于底物的不同，制備抗氧化肽所選用的蛋白酶也不同。表1列舉了部分研究者制備水產(chǎn)品抗氧化肽所選用的酶。

表1 制備水產(chǎn)抗氧化肽選擇用酶Tab.1 The selection of proteolytic enzymes to prepare aquatic antioxidant peptides

另外，除采用外源蛋白酶外，有學者利用魚類含有的內(nèi)源性蛋白酶，制備出水產(chǎn)抗氧化肽。SAMARANAYAKA和CHAN[19]利用太平洋鱈魚Merluccius productus肉中感染寄生蟲Kudoa paniformis產(chǎn)生的蛋白酶水解活性，制備鱈魚肉抗氧化肽，其中E-1h FPH組分在亞油酸自氧化體系中的抗氧化活性高于BHA和α-生育酚。JE等[20]采用自制的“鮐魚腸天然酶(MICE)”水解狹鱈Theragra chalcogramma魚排蛋白，魚排蛋白水解產(chǎn)物(APH)被分成5種分子量大小不同的組分，其中分子量最小的APH-V組分具有最高的抗氧化活性，通過純化之后的多肽樣品濃度為53.6 μmol/L時，羥自由基清除率為35%。

3.1.2 發(fā)酵法

許多水產(chǎn)品經(jīng)發(fā)酵后，在微生物和內(nèi)源酶的作用下，有機物質(zhì)轉(zhuǎn)變成了小分子物質(zhì)如肽類、氨基酸類和其它含氮化合物。其中的多肽和氨基酸不僅對發(fā)酵產(chǎn)物的風味起重要貢獻，而且對產(chǎn)品的抗氧化功效起到貢獻作用。發(fā)酵法與酶解法相比，能將微生物產(chǎn)酶和酶水解兩步合一，省去酶的分離和提純步驟，減少生產(chǎn)工序，降低成本。

RAJAPAKSE等[21]通過分離純化紫貽貝Mytilus edulis發(fā)酵液，制備出具有重復序列“HFGBPFH”的多肽，經(jīng)檢測其具有較高的自由基清除能力、Fe2+螯合能力及提高氧化損傷細胞成活率的作用。PERALTA等[22]研究了菲律賓傳統(tǒng)食鹽發(fā)酵的蝦Acetes spp醬的抗氧化性，結(jié)果證明通過適當延長發(fā)酵時間，在有效地增加自由氨基酸含量的同時，也提高了蝦醬的抗氧化能力。

3.2 分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

從目前報道的水產(chǎn)品抗氧化肽來看，分子量多集中在1 000 Da左右，氨基酸殘基的數(shù)目一般在20個以內(nèi)，而且，在抗氧化肽粗品中，肽的種類較多，活性肽組分對外界環(huán)境條件也比較敏感，因此，分離純化較困難，通常采用單一的分離純化手段不能達到理想的分離效果。目前，普遍采用多種分離技術(shù)聯(lián)用的手段。一般的分離純化流程如圖1所示。

圖1 分離純化流程圖Fig.1 The flow chart of isolation and purification

超濾(UF)是膜分離技術(shù)的一種，實踐證明膜技術(shù)具有耗能低、設(shè)備小、操作管理方便和質(zhì)量好等優(yōu)點。近年來，超濾技術(shù)已經(jīng)被應用于水產(chǎn)品抗氧化肽的分離純化。MENDIS等[13]采用10 kDa，5 kDa和3 kDa 3種膜截留魷魚皮明膠水解產(chǎn)物，初步篩選出小于3 kDa分子量的抗氧化活性最強組分。

離子交換色譜(IEC)是多肽分離純化過程中經(jīng)常采用的方法，它是以離子交換劑為固定相，根據(jù)流動相中組分離子與交換劑上平衡離子進行可逆交換時，結(jié)合力大小差異而進行分離的一種層析方法。很多的研究者采用SP-Sephadex C-25陽離子交換色譜分離水產(chǎn)品抗氧化活性組分。如狹鱈Theragra chalcogramma魚排[20]、巨魷魚Dosidicus gigas肉[14]超濾活性組分等。

凝膠層析(GC)又稱凝膠排阻色譜、分子篩層析和凝膠過濾等，是利用分子大小和形狀差異進行分離的一種溫和、高效的方法。Sephadex G-25凝膠柱層析是分離小分子量水產(chǎn)抗氧化肽采用的最多的一種，如乳酸發(fā)酵蝦Penaeus mondon廢棄物[7]。另外，有學者采用Superdex Peptide10/300 GL凝膠柱純化牛蛙Rana catesbeiana Shaw[12]皮和草魚Ctenopharyngodon idellus[15]水解物。

為了獲得活性最高的多肽純化物，通常采用高效液相色譜(HPLC)法進行分離純化驗證。高效液相色譜是近年來肽的分離純化中廣泛應用的技術(shù)，主要用于10 kDa以下的極性小分子肽的分離純化。RAJAPAKSE等[21]采用nucleosil 100-7 C18 HPLC柱和Zorbax SB C18 HPLC柱兩步分離，制得962 Da的活性最高抗氧化肽純品。KIM等[16]將離子交換層析后的活性最高組分進一步經(jīng)HPLC分離，分別采用了1次Capcell Pak C18UG-120柱和2次Synchropak RPP-100 RP-HPLC analytical柱，制得抗氧化肽純品。對最終制得的高純度抗氧化肽，通常采用質(zhì)譜(CM)進行分子量的測定，推測其氨基酸序列。

4 水產(chǎn)抗氧化肽活性評估方法

評估水產(chǎn)抗氧化肽的活性，一般采用自由基清除能力、抗脂質(zhì)自氧化能力、金屬離子螯合能力、協(xié)同抗氧化能力等多種評價方法進行體外活性實驗評估。經(jīng)篩選出的具有抗氧化活性的物質(zhì)可通過體內(nèi)試驗進一步檢驗評估。

4.1 清除自由基

自由基是指一類可以獨立存在的含有未配對電子的物質(zhì)，包括分子、原子、原子團或離子。主要包括超氧陰離子(O2-·)、過氧化氫(H2O2)、羥自由基(OH·)、單線態(tài)氧(1O2)等，這些自由基具有不穩(wěn)定性和高反應性?？寡趸瘎┛梢杂行У貙⑿孤┏鰜淼?、多余的活性氧等清除掉，從而保護細胞、組織免遭氧化損傷。

目前抗氧化肽的自由基清除效果，普遍采用自由基清除率來表示。二苯代苦味酰肼自由基 (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，簡稱DPPH)是一種較穩(wěn)定的自由基。當有自由基清除劑存在時，DPPH自由基的單電子被分配而使其顏色變淺，利用分光光度法可以檢測自由基清除情況，從而評價樣品抗氧化能力。羥自由基是化學性質(zhì)最活潑的活性氧自由基，它帶有1個不成對的電子，是對人體毒性最大的自由基，它反應速度極快，可以與活細胞中的大分子如蛋白和DNA發(fā)生反應而造成損害[23]。因此，較多的研究者選用以上2種自由基的清除率來評估水產(chǎn)蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化性。

除此之外，超氧陰離子自由基[24]、過氧化氫自由基[25]等的清除率也被一些學者作為綜合評價水產(chǎn)多肽抗氧化能力的選擇方法。

4.2 抑制脂質(zhì)自氧化

脂類的自氧化是造成食品質(zhì)量下降最主要的化學因素之一。尤其是富含不飽和脂肪酸的食品，很容易氧化生成過氧化脂質(zhì)，再經(jīng)過分解、聚合等反應產(chǎn)生腐敗直至出現(xiàn)毒性。另一方面，在生物體內(nèi)，癌癥的發(fā)生以及衰老也都與體內(nèi)脂肪的氧化有關(guān)。因此,脂類常作為被氧化的底物用來檢測樣品的抗氧化能力。

水產(chǎn)抗氧化肽抑制脂質(zhì)自氧化的效果，一般采用以亞油酸為氧化底物的亞油酸模型系統(tǒng)。亞油酸通過吸收空氣中的氧進行自動氧化反應，產(chǎn)生脂肪酸氫過氧化物。水產(chǎn)抗氧化肽的添加，可以抑制自氧化反應。通過比較兩種情況下的氫過氧化物的含量，來評估抑制脂類自氧化的效果。很多報道均采用硫氰酸鐵法[26]檢測氫過氧化物的含量。該法的原理是亞鐵離子可被氫過氧化物氧化成高鐵離子，其反應為Fe2++2H++O→Fe3++H2O，然后加入硫氰酸銨與Fe3+形成紅色的絡合物，其在540 nm處有強吸收值，通過比色即可測出氫過氧化物的含量。

4.3 金屬離子螯合能力

過渡態(tài)金屬離子如Fe2+和Cu2+能催化不飽和脂質(zhì)氧化過程中自由基的形成[27]，而水解產(chǎn)生的多肽的羧酸基團和氨基基團具有金屬離子螯合能力，因此，能夠削弱脂質(zhì)的氧化。由于水解過程中多肽的斷裂，導致了肽片段濃度的增加，從而有助于清除羥自由基中的金屬離子，產(chǎn)生抗氧化性。

DONG等[10]研究了鰱魚蛋白水解物的金屬離子螯合活性。隨著水解時間的增加，水解產(chǎn)物的螯合活性增強。其中，在任何時間段時，堿性蛋白酶的水解產(chǎn)物的活性均比風味蛋白酶高。經(jīng)堿性蛋白酶水解6 h的水解物的金屬離子螯合活性最高，達92.97%。并且螯合活性和水解度(DH)之間存在線性關(guān)系。結(jié)果證明低分子量的水解產(chǎn)物具有較高的金屬離子螯合活性。

4.4 協(xié)同抗氧化性

在水產(chǎn)品水解物中也有協(xié)同抗氧化活性肽的報道。這類抗氧化肽本身的抗氧化能力比較低，但是在與其它一些抗氧化劑同時使用時，具有很強的抗氧化效果。JE等[20]研究了狹鱈魚排的水解產(chǎn)物，經(jīng)超濾膜過濾后的5種組分中，僅APH-Ι無協(xié)同抗氧化性，其它組分在亞油酸模型系統(tǒng)中均具有同α-生育酚的協(xié)同抗氧化性。

4.5 細胞損傷模型

最近幾年，越來越多的研究者采用細胞損傷模型評估抗氧化活性。氧化作用在細胞的損傷死亡中扮演重要角色，通過添加抗氧化劑對抗細胞中產(chǎn)生的氧化作用，能夠提高細胞的成活率。MENDIS等[13]通過建立人工培養(yǎng)的人類肺臟纖維細胞模型，采用MTT法，檢測t-BHP介導的氧化損傷細胞的成活率，結(jié)果顯示，在與天然抗氧化劑α-生育酚相比時，魷魚皮明膠多肽能顯著提高細胞成活率。

4.6 體內(nèi)實驗

通過體內(nèi)實驗驗證樣品的抗氧化性，是活性評估中最重要的一環(huán)。通常將受試物連續(xù)飼喂大鼠或小鼠1-3月，然后處死，測定其血或組織(如肝、腦)中MDA、單胺氧化酶(MAO-B)及抗氧化酶SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及過氧化氫酶(CAT)，同對照組比較，若 MDV、MAO-B 降低，SOD、GSH-Px、CAT 等升高，則說明受試物具有抗氧化能力。

林琳和李八方[28]研究了具有清除自由基作用的魷魚多肽的體內(nèi)抗氧化活性。采用D-半乳糖致衰的小鼠模型，結(jié)果表明分子量小于2 kDa的多肽組分，能夠提高小鼠血液及皮膚中SOD和GSH-Px的活力，降低MDA含量，并提高小鼠皮膚中Hyp的含量。

5 影響水產(chǎn)抗氧化肽活性的因素

5.1 水解過程因素

通過水解制備出的抗氧化肽的活性與底物原料、酶的種類、酶解溫度、酶解時間、酶的加入量、pH、以及酶解產(chǎn)物的水解度(DH)等許多因素有關(guān)。

KLOMPONG等[18]采用堿性蛋白酶和風味蛋白酶水解黃斑紋鲹魚蛋白制得2種水解產(chǎn)物分別為HA和HF。采用不同的酶，活性宜有變化。當水解度增加時，HA的DPPH自由基清除活性和還原能力增強，HF并無此現(xiàn)象。HA和HF的金屬離子螯合能力均隨著水解度的增加而增強。并且，在相同的水解度時，HF的金屬離子螯合能力通常比HA高。在低水解度(DH=5%)時，HA的DPPH自由基清除活性較好，同時，在高的水解度(DH=25%)時，HF的還原能力較好。也有研究者研究了堿性蛋白酶處理的鰱魚蛋白水解產(chǎn)物，羥自由基清除活性和亞油酸過氧化抑制率分別在水解時間為1.5 h和2.0 h時達到最大值，證明鰱魚水解蛋白抗氧化能力是與水解度和水解時間相關(guān)[10]。

表2 水產(chǎn)抗氧化肽的序列結(jié)構(gòu)及分子量Tab.2 The peptide sequence and molecular weight of aquatic antioxidant peptides

5.2 肽的化學結(jié)構(gòu)

抗氧化肽的功能特性較多地受分子結(jié)構(gòu)和分子量的影響[29,30]。MURASE等[31]認為，抗氧化肽的疏水性增強了它的抗氧化性和乳化效果，并且，這類多肽在同非肽類抗氧化劑協(xié)同時具有比較強的協(xié)同效果。CHEN等[32]認為組氨酸含量較高的多肽，具有金屬離子螯合作用。另外，一些其它的氨基酸，比如，組氨酸、脯氨酸、丙氨酸和亮氨酸，被報道對自由基清除有貢獻作用[33]。SUETSUNA等[30]報道了亮氨酸出現(xiàn)在C端具有抗氧化性，并認為在多肽結(jié)構(gòu)中芳香族氨基酸的酚羥基基團能夠作為有效的電子供體。MENDISA等[13]報道了魷魚皮明膠抗氧化肽P1和P2的抗氧化性來源于序列中富含間隔的“親水-疏水”序列，同時，由于分子量較低，P1比P2具有更高的抗氧化特性。表2為部分水產(chǎn)抗氧化肽的序列結(jié)構(gòu)及分子量。

另外，除以上兩方面外，抗氧化肽所處的pH、溫度等外界條件同樣影響活性的發(fā)揮。BISAN等[8]研究表明，白蝦抗氧化肽，在pH 2～11，溫度為25～100℃范圍內(nèi)，F(xiàn)ARP、TBARS和DPPH 3種活性仍然高于80%?；钚噪脑?00℃加熱30 min時，3種活性稍微降低，30～120 min時，3種活性維持在80%左右，120～150 min時，DPPH活性稍微降低。

6 水產(chǎn)抗氧化肽研究展望

我國是水產(chǎn)品加工大國，每年都會產(chǎn)生大量的低值水產(chǎn)品下腳料蛋白資源，開發(fā)利用水產(chǎn)抗氧化肽將具有不菲的經(jīng)濟效益和社會意義。水產(chǎn)抗氧化肽能有效地清除體內(nèi)的活性氧自由基，保護細胞和線粒體的正常結(jié)構(gòu)和功能，同時防止食品脂質(zhì)過氧化變質(zhì)，在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域具有廣泛的應用前景。但水產(chǎn)抗氧化肽的研究中仍有不少問題需要解決。第一、有關(guān)抗氧化能力的測定方法很多，但是通用的方法很少，使得各種實驗缺乏可比性，需統(tǒng)一抗氧化能力測定標準；第二、水產(chǎn)抗氧化肽單一組分和不同組分協(xié)同作用的機制等還有待深入研究；第三、有關(guān)水產(chǎn)抗氧化肽的活性研究大多缺乏臨床試驗，體內(nèi)抗氧化機理還需要進一步深入研究；第四、對于水產(chǎn)抗氧化肽在濃縮干燥過程中的活性損失，還缺乏系統(tǒng)性的深入研究；第五、在抗氧化肽分離純化的研究中，鹽的存在一定程度上會影響抗氧化活性的測定，但是脫鹽問題一直沒能得到很好的解決；第六、目前的分離純化手段很難純化得到分子量很小、由2～3個氨基酸組成的肽段，這也是大多數(shù)研究報道所得到的抗氧化肽分子量都大于500 Da的原因之一。

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