楊漢奇，阮楨媛，田 波，楊宇明，孫茂盛

（1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 資源昆蟲研究所，云南 昆明 650224；2.西南林學(xué)院 資源學(xué)院，云南 昆明 650224；3.中國(guó)科學(xué)院 西雙版納熱帶植物園 昆明分部，云南 昆明650223）

巨龍竹Dendrocalamus sinicus是目前世界上已知最高大的竹種，竹稈高為25～35 m，胸徑為20～30 cm，平均質(zhì)量為100～150 kg·株-1，多用于竹建筑、竹紙漿等原材料，是中國(guó)南部熱區(qū)發(fā)展竹產(chǎn)業(yè)和生態(tài)環(huán)境建設(shè)中具極大發(fā)展?jié)摿Φ膬?yōu)良經(jīng)濟(jì)竹種之一［1］。巨龍竹自然分布僅限于云南西南部和南部局部海拔1 800 m以下的山谷和壩區(qū)。最近的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，巨龍竹核心分布區(qū)為云南西南部阿佤山地區(qū)，而且稈形通直粗大，并且充分體現(xiàn)了當(dāng)?shù)匾载糇鍨橹鞯拿褡逯裎幕?，具有顯著的民族文化保護(hù)價(jià)值；而云南南部分布區(qū)種群少，稈形多彎曲，不適合于生產(chǎn)竹材［2］。由于巨龍竹分布狹域，種源稀少，自然結(jié)實(shí)率極低，目前無(wú)性繁殖苗木困難，亟需開展相關(guān)的保護(hù)生物學(xué)研究工作［2］；另一方面，近年來(lái)通直型巨龍竹已經(jīng)在云南其他熱區(qū)被較大規(guī)模的引種栽培，但忽視了種源的選優(yōu)和遺傳品質(zhì)的鑒定，使得巨龍竹的推廣栽培面臨著潛在的風(fēng)險(xiǎn)。簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增（ISSR，inter-simple sequence repeat）分子標(biāo)記是Zietkiewicz等在簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記（SSR，simple sequence repeat）技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展的一種新的微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)［3］，同SSR等其他分子標(biāo)記相比，ISSR技術(shù)具有靈敏性高，費(fèi)用低，實(shí)驗(yàn)難度低等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為目前遺傳多樣性分析中最常用的技術(shù)手段之一，在遺傳圖譜構(gòu)建［4］、遺傳多樣性分析［5］和種質(zhì)資源鑒定［6］等方面得到廣泛應(yīng)用。最近，ISSR技術(shù)也開始應(yīng)用于竹子遺傳多樣性方面的研究，Lin等［7］利用ISSR技術(shù)發(fā)現(xiàn)毛竹Phyllostachys pubescens 10個(gè)栽培變型間具有很高的遺傳相似性。本研究旨在利用ISSR分子標(biāo)記研究巨龍竹核心分布區(qū)內(nèi)不同地理種源間的遺傳分化水平，為保護(hù)這一珍貴的竹子種質(zhì)資源以及擴(kuò)大栽培和利用提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇云南西南部巨龍竹核心分布區(qū)內(nèi)不同海拔、地理距離較遠(yuǎn)且有代表性的4個(gè)通直型近天然種群（表1），采集幼嫩枝葉作為試驗(yàn)材料，每個(gè)采樣點(diǎn)根據(jù)巨龍竹的分布情況隨機(jī)采樣，每叢至少相距50 m。

表1 用于ISSR分析的4個(gè)巨龍竹居群Table 1 Populations of Dendrocalamus sinicus for ISSR analysis

1.2 總DNA提取

采集生長(zhǎng)良好無(wú)病蟲害感染的幼嫩枝葉并用硅膠保存，參照十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法［8］提取總DNA；DNA濃度和純度用分光光度計(jì)檢測(cè)。

1.3 引物篩選與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增反應(yīng)

所用引物系列為加拿大哥倫比亞大學(xué)UBC公司公布的第 9套 ISSR引物序列（http：//www.biotech.ubc.ca/services/NAPS/Primer_Sets/Primers.pdf），由上海生工合成。引物篩選時(shí)每個(gè)居群隨機(jī)挑選2個(gè)模板在25 μL的反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增篩選，從其中80個(gè)引物中選取7個(gè)擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性好的引物（表2）用于全部4個(gè)居群樣本分析。

表2 ISSR引物序號(hào)與序列Table 2 The ISSR primers

PCR（polymerase chain reaction）反應(yīng)在 ABI Verity梯度PCR儀上進(jìn)行。25.0 μL反應(yīng)體系包括：10×buffer（100 mmol·L-1三羧甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）（pH 8.8）； 500 mmol·L-1氯化鉀（KCl）2.5 μL，5 mkat·L-1的 Taq DNA 聚合酶（fermentas）0.5 μL，25 mmol·L-1的氯化鎂（MgCl2）1.8 μL，10 mmol·L-1的三磷酸堿基脫氧核苷酸（dNTPs）（Takara，寶生物工程大連有限公司） 2.5 μL，10 μmol·L-1的引物（上海生工生物工程有限公司）1.5 μL，二甲基亞砜（DMSO）0.5 μL，50 mg·L-1的模板 DNA 0.7 μL，以及重蒸水（ddH2O）15.0 μL。

擴(kuò)增程序：94℃，5 min，1個(gè)循環(huán)；94℃，45 s，53～55°C（溫度依引物不同而改變），1 min，72℃，2 min，40個(gè)循環(huán)；72℃，7 min，1個(gè)循環(huán)。

1.4 PCR產(chǎn)物的凝膠電泳

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在 16.0 mg·L-1的瓊脂糖凝膠上電泳［0.5×TBE（Tris-硼酸），5 V·cm-1］分離，以 100 bp DNA Ladder Marker（100～3 000 bp）（fermentas）作標(biāo)記估算擴(kuò)增片斷大小，溴化乙錠（EB）染色后在凝膠成像系統(tǒng)（UPV）上顯像，觀察并記錄。

1.5 數(shù)據(jù)分析

電泳圖譜中每一擴(kuò)增條帶代表引物的一對(duì)結(jié)合位點(diǎn)且視為有效的分子標(biāo)記。同一引物的擴(kuò)增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的條帶被認(rèn)為具有同源性，依據(jù)ISSR標(biāo)記判讀電泳圖譜中擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)及其分子量大小，將電泳圖譜中清晰的條帶記作“1”，否則記作“0”，建立0/1數(shù)據(jù)矩陣［9－10］。應(yīng)用POPGENE 1.32［11］軟件計(jì)算多態(tài)性位點(diǎn)百分比，Nei’s基因多樣性指數(shù)（H），Shannon多態(tài)性信息指數(shù)（I），基因分化系數(shù)（Gst），基因流（Nm），Nei’s遺傳距離和遺傳一致度，并據(jù)此用算術(shù)平均非加權(quán)配組法（UPGMA）進(jìn)行聚類，分析各群體之間的遺傳關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

提取的4個(gè)種群的巨龍竹總DNA的吸光度D260/D280比值為1.6～2.0，顯示DNA樣品純度高。利用8.0 mg·L-1脂糖檢測(cè)提取的DNA濃度及純度，結(jié)果顯示DNA條帶清晰，沒有核糖核酸（RNA）污染，濃度合適（圖1），適合用于ISSR標(biāo)記技術(shù)分析。

圖1 巨龍竹孟連居群部分樣品總DNA電泳檢測(cè)圖Figure 1 The agarose electrophoretogram of Dendrocalamus sinicus total DNA extracted form samples of Menglian population

2.2 引物擴(kuò)增結(jié)果

優(yōu)選的7個(gè)條帶清晰、穩(wěn)定性高且相對(duì)較多條帶的引物用于全部樣品的PCR擴(kuò)增，各引物擴(kuò)增的條帶數(shù)如表2，部分引物的擴(kuò)增結(jié)果如圖2和圖3。

圖2 引物857對(duì)ML居群樣品的擴(kuò)增樣式Figure 2 ISSR bands of Menglian population samples amplified with primer 857

圖3 引物810對(duì)CY居群樣品的擴(kuò)增樣式Figure 3 ISSR bands of Cangyuan population samples amplified with primer 810

2.3 遺傳多樣性和遺傳分化分析

在檢測(cè)到的所有清晰且重復(fù)性好的73個(gè)有效位點(diǎn)中有54個(gè)多態(tài)位點(diǎn)；在物種水平上，多態(tài)位點(diǎn)百分率為73.97%，Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）和Shannon信息指數(shù)（I）分別為0.260 0和0.3921。從各個(gè)居群來(lái)看，西盟居群多態(tài)位點(diǎn)百分率（2.74%）最低，而孟連居群多態(tài)位點(diǎn)百分率（21.92%）最高，勐海居群和滄源居群的處于中等水平（表3）。居群間的遺傳分化系數(shù)（Gst）達(dá)0.863 4，表明在物種水平上，有13.66%的遺傳變異存在于居群內(nèi)，而86.34%的遺傳變異存在于居群間，居群之間表現(xiàn)出較高水平的遺傳分化。居群間的基因流（Nm）僅為0.079 1。

表3 巨龍竹居群內(nèi)的遺傳多樣性Table 3 Genetic variation in natural populations of Dendrocalamus sinicus

2.4 遺傳距離與聚類分析

根據(jù)Nei’s遺傳距離和遺傳一致度，用NTSYS-PC V2.11C軟件對(duì)4個(gè)居群進(jìn)行非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法（UPGMA，unweighted pair group method with arithmetic mean）聚類分析的結(jié)果見圖4：4個(gè)巨龍竹居群聚為一支；Nei’s遺傳距離（表4）顯示西盟居群和孟連居群的遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.572 6，勐海居群和滄源居群的遺傳距離最近，為0.247 0。

圖4 巨龍竹居群間Nei’s遺傳距離的UPGMA聚類圖Figure 4 UPGMA dendrogram for 4 Dendrocalamus sinicus populations based on Nei’s genetic distance

表4 巨龍竹的Nei’s遺傳一致度（對(duì)角線上方）和遺傳距離（對(duì)角線下方）Table 4 Nei’s original measures of genetic identity and genetic distance

3 結(jié)論與討論

本研究中巨龍竹4個(gè)居群間的Nei’s基因分化系數(shù)（Gst）達(dá)到了0.863 4，表現(xiàn)出較高水平的遺傳分化。Nybom總結(jié)了158份快速擴(kuò)增多態(tài)DNA（RAPD），27份擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）和13份ISSR植物材料的研究結(jié)果，其 Gst平均值分別為0.27，0.21和0.34［12］。與Nybom的結(jié)果比較，巨龍竹4個(gè)居群間表現(xiàn)出了遺傳分化大的特點(diǎn)，這表明在推廣栽培通直型巨龍竹的過(guò)程中，弄清種源的遺傳品質(zhì)是十分必要的。同時(shí)，由于通直型巨龍竹的遺傳多樣性豐富，不同居群間的遺傳分化水平較高，因此，在其種質(zhì)資源收集和保存時(shí)應(yīng)該廣泛地對(duì)其居群和竹叢加以充分的采樣，以保持其豐富的遺傳多樣性。

植物居群間的遺傳分化是其長(zhǎng)期進(jìn)化歷史（如分布范圍的改變、生境的片斷化和居群的隔離等）、遺傳漂變、繁育系統(tǒng)和基因流以及自然選擇等因素綜合作用的結(jié)果［13］。迄今為止，巨龍竹的進(jìn)化歷史還不清楚，但其生境片斷化趨勢(shì)較明顯：巨龍竹自然分布區(qū)基本與云南熱帶季雨林區(qū)相吻合，而且僅限于滇西南和滇南局部地區(qū)，種群隔離明顯；極端最低溫度是影響巨龍竹分布的關(guān)鍵制約因素之一，它直接影響到巨龍竹能否越冬存活，在調(diào)查的4個(gè)地區(qū)中，西盟（－2.3℃）、孟連（－0.6℃）、勐海（－5.4℃）和滄源（－4.3℃）之間差異較大［2］。由于生境片斷化和種群隔離效應(yīng)的結(jié)果，使得種群內(nèi)的變異程度降低，而種群間的遺傳分化程度加大［14－15］。

繁育系統(tǒng)一般被認(rèn)為是居群水平上影響遺傳分化關(guān)鍵因素之一，對(duì)基因流動(dòng)和選擇等居群遺傳參數(shù)影響較大［16-17］。木本竹子的繁育系統(tǒng)有著鮮明的特點(diǎn)：①竹類植物具有獨(dú)特的開花習(xí)性，即一個(gè)生命周期只開1次花，開花周期長(zhǎng)達(dá)幾十年甚至上百年；1株開花后同一個(gè)種同一來(lái)源的所有克隆植株均陸續(xù)開花，開花后絕大多數(shù)植株將死亡；②在傳粉生物學(xué)方面，竹子雖然是風(fēng)媒傳粉，但在野外多為零星開花，其花粉的傳播也是有限的；而且大部分竹子花粉存在大量敗育現(xiàn)象［18］。巨龍竹近年來(lái)在其分布區(qū)內(nèi)經(jīng)常觀察到單叢零星開花［19］，由于雌雄異熟，加之其開花授粉時(shí)期多在雨季使得其授粉困難，導(dǎo)致結(jié)實(shí)率極低［20］。由于巨龍竹自然條件下有性繁殖能力極弱，不能實(shí)現(xiàn)種子的傳播，影響其基因流的形成，導(dǎo)致其種群間個(gè)體遷移率小，基因流偏?。∟m為0.079 1），從而造成種群間遺傳分化明顯。

Wright認(rèn)為群體間的基因流值若小于1，則遺傳漂變可以導(dǎo)致居群間明顯的遺傳分化［21］。本研究調(diào)查的巨龍竹居群間基因流非常有限，顯示遺傳漂變對(duì)居群間遺傳分化的影響較小。這可能是由于叢生竹類一般具有較強(qiáng)的無(wú)性繁殖能力，能在一定程度上降低小種群的遺傳漂變，減輕了生境片斷化的影響。

致謝：感謝審稿人提出的寶貴建議。

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