李枚娟， 鞏 燕， 肖國勝， 李桂陽， 王焱△

(1廈門大學醫(yī)學院，2廈門大學附屬中山醫(yī)院心臟中心，福建 廈門 361000;3福建醫(yī)科大學，福建 福州 350108)

眾多的臨床和實驗研究表明，T細胞介導的自身免疫性疾病中動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)相關(guān)的心血管并發(fā)癥和死亡率明顯增加，支持T細胞介導的免疫調(diào)節(jié)顯著促進了此類疾病AS的發(fā)生和進展［1，2］。電壓依賴性鉀通道(votage dependent K+channel，Kv)在維持T細胞膜靜息電位和細胞狀態(tài)方面有重要作用［3，4］，其中Kvl.3通道在調(diào)節(jié) T細胞活化的過程中起重要作用［5，6］，針對特定的T淋巴細胞及其表面分子Kvl.3的功能調(diào)節(jié)可能成為AS發(fā)病機制和免疫治療的新靶點。因此，我們應(yīng)用大鼠的AS模型，研究脾組織CD4+T淋巴細胞膜Kv1.3通道表達、胞內(nèi)鈣離子濃度、細胞因子分泌變化三者之間的關(guān)系及Kv1.3通道在AS中的作用。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 采用4－8周健康雄性Wistar大鼠40只，體重(200±12)g，購自中科院上海斯萊克實驗動物有限公司。隨機分為2組，對照組(10只)采用普通飲食+生理鹽水，動脈粥樣硬化組(30只)采用高脂飲食配方(3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油、81.3%基礎(chǔ)飼料、蛋黃、牛奶)+維生素D3負荷(喂食開始時一次性腹腔注射維生素D36×105U/kg)，飼養(yǎng)16周，建立AS大鼠模型。

1.2 主要試劑 總膽固醇試劑盒、甘油三酯試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇試劑盒(北化康泰公司，北京)，淋巴細胞分離液(EZ－SepTMmouse 1×Dakewe公司，深圳)，anti－CD3單克隆抗體及mouse IgG3同型對照抗體(eBioscience)，anti－CD4及 mouse IgG1同型對照抗體、anti－CD8單克隆抗體及mouse IgG1同型對照抗體(Invitrogen)，CD4+T淋巴細胞分選試劑盒MagCellect Rat CD4+T－cell isolation kit(R＆D)，染料 fluo－3，AM(分子探針)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidTMfirst strand cDNA synthesis kit(Fermentas)。

2 方法

2.1 AS模型鑒定 大鼠處死后心臟采血，進行血脂測定。并取主動脈弓至髂總動脈全長血管，分別取主動脈起始部、胸主動脈、腹主動脈，用10%甲醛溶液固定，做石蠟切片(5 μm)后進行HE染色，光鏡下觀察組織改變。

2.2 流式細胞儀測定淋巴細胞比例 大鼠處死后取脾臟，進行淋巴細胞分離:采用EZ－SepTMmouse 1×淋巴細胞分離液，運用密度梯度離心法獲得脾淋巴細胞，并進行流式抗體雙標記，按1×109cells/L細胞計算所需抗體加入量:anti－CD42.5 μL(100 mg/L)，anti－ CD810 μL(100 mg/L)，anti－ CD31.25 μL(200 mg/L)，mouse IgG310 μL(10 μL/test)，mouse IgG110 μL(10 μL/test)，通過流式細胞術(shù)測定不同淋巴細胞群的數(shù)量及比例。

2.3 CD4+T淋巴細胞磁珠分選(magcellect rat CD4+T－cell isolation kit，MACS)及純度檢測 采用Mag-Cellect rat CD4+T－cell isolation kit，分選出CD4+T淋巴細胞，并取出1×109cells/L再次進行anti－CD4、anti－CD8、anti－ CD3，及其同型抗體 mouse IgG3、mouse IgG1標記，檢測CD4+T淋巴細胞純度。

2.4 脾CD4+T淋巴細胞增殖程度檢測 分別取正常對照組和AS組經(jīng)磁珠分選出的CD4+T淋巴細胞，加入10%進口胎牛RPMI－1640培養(yǎng)基，用96孔板進行細胞培養(yǎng)，分為不加非特異性刺激劑刀豆蛋白A組［concanavalinA，ConA(－)組］，及加入 ConA組［ConA(+)組］(終濃度為 5 g/L)，于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，加入MTT(終濃度5 g/L)進行顯色反應(yīng)，4 h后經(jīng)DMSO終止反應(yīng)，對其增殖程度進行測定。

2.5 激光共聚焦(confocal)檢測脾CD4+T淋巴細胞胞內(nèi)鈣離子(Ca2+)濃度 分別取對照組和實驗組經(jīng)磁珠分選出的CD4+T淋巴細胞1×109cells/L，用Flou－3/AM(5 μmol/L)進行細胞內(nèi)鈣離子染色，避光孵育30 min，經(jīng)共聚焦顯微鏡分別檢測2組脾CD4+T淋巴細胞胞內(nèi)鈣離子濃度，同時取等量的細胞加入10%進口胎牛RPMI－1640培養(yǎng)基，并加入ConA(終濃度為5 mg/L)及 CaCl2(2.0 mmol/L)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，48 h后分別將對照組和實驗組經(jīng)ConA和CaCl2共培養(yǎng)的細胞1×106采用同樣的方法檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度，并進行刺激前后胞內(nèi)鈣離子濃度的比較。

2.6 實時定量RT－PCR檢測正常對照組和AS組脾CD4+T淋巴細胞Kv1.3 mRNA的表達量變化分別提取2組大鼠的脾CD4+T淋巴細胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidTMfirst strand cDNA synthesis kit，合成cDNA模板。采用ABI7500進行實時定量RT－PCR(qRT－PCR)檢測，引物序列如下，Kv 1.3引物:5’－TCGTGTCAGTGCTGGTCATTCTC，3’－TTGGCAGCCTCAAACACGTC;GAPDH 引物:5’－GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG，3’－ ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA。分別檢測2組大鼠脾CD4+T淋巴細胞Kv1.3 mRNA的表達量并對其CT值及溶解曲線進行分析比較。

3 統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1 正常組和AS組大鼠的主動脈血管病理改變

HE染色可見，對照組內(nèi)皮細胞連續(xù)完整而光滑，中膜平滑肌走行清晰，中膜血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)排列整齊無增生，彈力纖維未見異常;AS組部分內(nèi)皮細胞脫落，中層明顯增厚，彈力纖維走形異常，VSMCs細胞核排列紊亂。主動脈血管內(nèi)超聲檢測，可見內(nèi)膜下脂質(zhì)沉積，動脈管壁鈣化，符合AS病變特點，見圖1。

Figure 1.Pathologic change in rat aorta after being feeding with fat diet(HE staining，×100).A:rat aorta in control group;B:rat aorta in AS group.圖1 對照組與實驗組大鼠主動脈血管病理變化

2 正常組和AS組大鼠的總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(low － density lipoprotein，LDL)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)水平比較

AS組大鼠TC和LDL水平顯著高于對照組，差異顯著(P＜0.05)。AS組TG、HDL水平與對照組比，差異無顯著，見圖2。

3 正常對照組和AS組大鼠脾組織CD4+T淋巴細胞比例比較

AS組脾組織CD4+T淋巴細胞比例較對照組升高，見圖3。正常對照組和AS組大鼠脾組織T淋巴細胞經(jīng)磁珠分選后CD4+T淋巴細胞比例均可達到85%以上，見圖4。

4 ConA刺激對照組和AS組大鼠脾CD4+T淋巴細胞48 h后淋巴細胞增殖情況比較

對照組和AS組大鼠脾CD4+T淋巴細胞在未加ConA的情況下，即存在基礎(chǔ)增殖程度的差異，AS組細胞增殖程度較對照組升高，差異顯著(P＜0.05)。在加入ConA刺激48 h后2組細胞均有明顯增殖，但AS組的升高更顯著，差異顯著(P＜0.05)，見表1。

Figure 2.Comparison of serum TC and LDL(total cholesterol and low－density lipoprotein)between AS and control group..n=30.*P＜0.05 vs control group.圖2 正常組和AS組大鼠血清中血脂水平比較

Figure 3.Comparison of CD4+T lymphocyte proportion in rat spleen between AS and control group.A:proportion of CD4+T cell in control rat spleen;B:proportion of AS－ CD4+T cell in AS rat spleen.Proportion of CD4+T lymphocyte in AS group was significantly higher than that in control group.圖3 對照組與實驗組大鼠脾CD4+T淋巴細胞比例比較

Figure 4.Proportion of CD4+T lymphocyte in AS rat spleen after being separated by immunomagnetic bead.圖4 磁珠分選后脾CD4+T淋巴細胞比例

表1 正常組和AS組大鼠脾CD4+T淋巴細胞增殖程度比較Table 1.After being stimulated by concanavalin A(ConA)，the proliferation of CD4+T lymphocyte in AS group and control group(A.)

表1 正常組和AS組大鼠脾CD4+T淋巴細胞增殖程度比較Table 1.After being stimulated by concanavalin A(ConA)，the proliferation of CD4+T lymphocyte in AS group and control group(A.)

*P ＜0.05 vs control.

Group ConA(－) ConA(+)Control(n=6)0.2013 ±0.0164 0.7971 ±0.0955 AS(n=9) 0.2965 ±0.0233* 1.1321 ±0.1750*

5 ConA刺激對照組和AS組大鼠CD4+T淋巴細胞后淋巴細胞內(nèi)鈣離子濃度比較

未加入ConA刺激前AS組CD4+T淋巴細胞就存在細胞內(nèi)鈣離子濃度高于正常對照組，兩者比較存在顯著差異(H=61.5，P＜0.05)，經(jīng)ConA刺激后兩者CD4+T淋巴細胞胞內(nèi)鈣離子濃度均有增加，實驗組增加更明顯，兩者相比差異顯著(H=82，P＜0.05)，見圖 5。

Figure 5.Comparison of intracellular calcium concentration between AS and control group.After being stimulated by ConA，the intracellular calcium concentration in AS group was significantly higher than that in the control group.圖5 正常對照組和AS組大鼠CD4+T淋巴細胞胞內(nèi)鈣離子濃度比較

6 ConA刺激大鼠CD4+T淋巴細胞不同時間細胞因子的分泌比較

ConA刺激分選出的CD4+T淋巴細胞，0 h時細胞因子分泌量低，作為空白對照，在刺激24 h及48 h后，IL－10的分泌水平未見明顯變化，而IL－2及TNF－α的分泌隨時間延長分泌增多，ConA刺激48 h后其分泌水平較24 h增多，差異顯著(P＜0.05)，見圖6。

Figure 6.Cytokine secretion in supernatant of CD4+T lymphocyte in different time after being stimulated by ConA..n=18.*P＜0.05 vs 24 h group.圖6 ConA刺激AS大鼠不同時間的細胞因子的分泌

7 對照組與AS組Kv1.3的qPCR結(jié)果比較

AS組脾CD4+T淋巴細胞Kv1.3 mRNA的表達高于正常對照組，差異顯著(P＜0.05)，見表2。

表2 對照組與AS組Kv1.3 mRNA表達量比較Table 2.Comparison of Kv1.3 mRNA expression in CD4+T lymphocytesof rat spleen between AS and control group()

表2 對照組與AS組Kv1.3 mRNA表達量比較Table 2.Comparison of Kv1.3 mRNA expression in CD4+T lymphocytesof rat spleen between AS and control group()

*P ＜0.05 vs control.

Group ΔCT:CTKv1.3 － CTGAPDH ΔΔCT:ΔCTAS－ΔCTcontrol 2 － ΔΔCT Control(n=7)7.576 ±1.038 1 AS(n=13) 5.910 ±0.785 －2.123 ±0.556 3.670 ±1.579*

討 論

AS是一種自身免疫性疾病，目前報道與AS關(guān)系密切的抗原有氧化低密度脂蛋白(oxidized low－density lipoprotein，ox－LDL)、熱休克蛋白 60、β2糖蛋白 I、脂蛋白a、肺炎衣原體、幽門螺桿菌、病毒等［7］，其中ox－LDL發(fā)揮主要作用。研究表明在ox－LDL刺激下可出現(xiàn)AS疾病的自身免疫應(yīng)答，使局部斑塊及脾臟中TGF－β1(+)CD4(+)Th3 表達增多［8］。我們通過高脂飲食建立動脈粥樣硬化大鼠模型，測定血脂提示存在高低密度脂蛋白血癥。且在未加ConA的情況下，AS組CD4+T淋巴細胞增殖程度較正常對照組升高，說明AS組在長期的高脂血癥的刺激下存在免疫機制，使CD4+T淋巴細胞處于增殖活化狀態(tài)。因此，我們的結(jié)果與上述報道是一致的。

T淋巴細胞功能活化有賴于其細胞膜表面的離子通道。研究表明，T淋巴細胞膜上主要存在3種離子通道蛋白:電壓門控鉀通道Kv1.3、鈣離子激活的鉀通道和鈣釋放激活的鈣通道。其中，Kv1.3通道是效應(yīng)性T淋巴細胞持續(xù)活化的關(guān)鍵［9，10］。Kv1.3通道的表達和功能改變主要影響膜電位水平和胞內(nèi)鈣信號，并調(diào)節(jié) IL－2、IL－10、TNF－α、TFG －β1等細胞因子的表達和細胞增殖［9，11，12］。

我們的研究表明，活化狀態(tài)的CD4+T淋巴細胞胞內(nèi)鈣離子濃度升高，致AS的細胞因子(IL－2，TNF－α)增多，并隨時間延長而增多，而減少局部炎癥反應(yīng)的細胞因子(IL－10)分泌水平較低。說明在持續(xù)的抗原刺激下，隨著AS疾病的進展，致AS的細胞因子(IL－2，TNF－α)分泌增加，加速疾病的進展;而IL－10作為抗炎因子，可抑制致炎因子的釋放，減少黏附分子的表達，減少單核細胞向內(nèi)皮細胞黏附，起到保護作用，有臨床研究證實，IL－10在AS斑塊進展、破裂、血栓方面有重要作用［13］，我們的AS組中IL－10水平在48 h內(nèi)未見變化趨勢，考慮與疾病發(fā)展時期及嚴重程度有一定關(guān)系，有待進一步研究。

已有的基礎(chǔ)及臨床研究均有力證實了Kv1.3通道在效應(yīng)性T細胞活化中的決定性作用，以及高表達Kv1.3通道的T淋巴細胞亞群在T細胞介導的自身免疫性疾病中的關(guān)鍵性致病作用［10，14］。最近研究報道:急性冠脈綜合征患者外周血T淋巴細胞Kv1.3通道電流幅度及Kv1.3蛋白的表達明顯高于正常人，該研究首次提出了 AS與 Kv1.3之間的相關(guān)性［15］。新近也直接在冠心病患者AS斑塊病變組織中發(fā)現(xiàn)了克隆性的T淋巴細胞增殖［16］，這些均提示Kv1.3在AS中存在一定作用。我們的研究也證明了在AS中，CD4+T淋巴細胞亞群增多，AS組CD4+T淋巴細胞表面Kv1.3離子通道在mRNA水平的表達增多，并且伴隨著CD4+T淋巴細胞胞內(nèi)鈣離子增多，炎癥細胞因子(IL－2，TNF－α)分泌增加，提示CD4+T淋巴細胞表面Kv1.3表達與胞內(nèi)鈣離子濃度、細胞因子分泌三者之間存在一定的相關(guān)性，Kv1.3離子通道在AS的疾病過程中發(fā)揮一定的作用。

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