張 菊， 關(guān)恒云， 張鵬舉， 陳蔚文， 陳兆波， 倪娜娜， 朱聞捷，王 坤， 胡小燕， 姜安麗△

(山東大學(xué)1醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所，2醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012)

同源盒基因(homeobox genes)最早在果蠅中發(fā)現(xiàn)，是一類編碼同源域蛋白調(diào)控胚胎發(fā)育分化的基因。NKX3.1是從小鼠基因組克隆出的新的同源盒基因NK家族成員，位于鼠的14號染色體。人類的同源盒基因 NKX3.1，定位于8p21［1］，長度為3.5 kb，有2個外顯子，第2個外顯子含有同源框序列。NKX3.1在功能上屬于核轉(zhuǎn)錄因子，特異親和的序列為TAAGAA［2］。研究表明NKX3.1基因在前列腺上皮及前列腺癌組織特異表達(dá)，并與前列腺癌的進(jìn)展、轉(zhuǎn)型有關(guān)，可能作為抑癌基因發(fā)揮作用［3］。

Dicer首先也是在果蠅中發(fā)現(xiàn)的，由DCR基因編碼。在果蠅中有Dcr－1，Dcr－22種亞型，但在人類只有Dicer1基因［4］。人的Dicer1基因定位于染色體14q32.13，全長52.3 kb，包括28個外顯子和27個內(nèi)含子。Dicer1編碼蛋白屬于RNaseⅢ家族［5］，在許多組織中廣泛表達(dá)，在miRNA的成熟過程中起著重要的作用。miRNA是一類長度很短的非編碼單鏈小分子RNA，參與體內(nèi)多種代謝過程，包括細(xì)胞分化、生物發(fā)育、癌癥等［6］。miRNA let－7a是 miRNA 家族中已發(fā)現(xiàn)的成員之一，包括miRNA let－7a－1、miRNA let－7a－2、miRNA let－7a－3［7］。最近研究顯示miRNA let－7a－1在多種腫瘤，包括前列腺癌中表達(dá)是下調(diào)的，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［8］。

本研究采用基因芯片檢測NKX3.1對前列腺癌細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響，發(fā)現(xiàn)NKX3.1可上調(diào)前列腺癌細(xì)胞中Dicer1基因的表達(dá)，進(jìn)一步通過RTPCR和Western blotting檢測證實 NKX3.1可上調(diào)Dicer1基因表達(dá)。為了檢測成熟miRNA let－7a－1作用，構(gòu)建了miRNA let－7a－1靶序列－報告基因重組質(zhì)粒。同時將miRNA let－7a－1靶序列－報告基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞PC3細(xì)胞和PC3(+)細(xì)胞中，結(jié)果顯示，PC3(+)細(xì)胞中熒光素酶活性明顯下降，表明Dicer1基因能有效促進(jìn)miRNA let－7a－1的成熟，成熟的miRNA let－7a－1結(jié)合靶序列后，抑制了報告基因熒光素酶活性表達(dá)。為今后進(jìn)一步探討NKX3.1上調(diào)Dicer1的具體機(jī)制及其miRNA let－7a－1在前列腺癌中作用奠定了基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料

質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)(本實驗室構(gòu)建)［9］、Trizol試劑購自Invitrogen;質(zhì)粒pMIR－reportTM購自Ambion;限制性內(nèi)切酶、Taq酶、PCR試劑盒購于大連寶生物工程公司;M－MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自Fermentas;前列腺癌PC3細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞所;鼠抗人Dicer1抗體購自Zamed，羊抗鼠lgG購于北京中杉金橋公司;RPMI－1640培養(yǎng)基購于Gibco;基因組芯片，上?？党缮镉邢薰?其余試劑為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 PC3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建 前列腺癌PC3細(xì)胞以1×107cells/L接種于24孔板中，當(dāng)細(xì)胞匯合至約90%時，將 NKX3.1真核表達(dá)載體 pcDNA3.1－NKX3.1純化定量后用FuGENE?HD試劑轉(zhuǎn)染前列腺癌PC3細(xì)胞，對照組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體。轉(zhuǎn)染24 h后，換用200 mg/L G418的 RPMI－1640篩選，10－14 d后可見陽性克隆，有限稀釋法克隆培養(yǎng)獲得NKX3.1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的前列腺癌PC3細(xì)胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1－NKX3.1的前列腺癌PC3細(xì)胞命名為PC3(+)。

2.2 基因芯片檢測 分別用Trizol試劑提取PC3細(xì)胞和PC3(+)細(xì)胞總RNA。對樣品RNA進(jìn)行熒光標(biāo)記，取 10 μg RNA，以 T7 －Oligo(dT)5'－AAACGACGGCCAGTGAATTGTAATAGACTCACTATAGGCGCTTTTTTTTTTTTTTTTV－3'為引物(V可以是 G、C和A)，用cDNA synthesis kit合成雙鏈cDNA。雙鏈合成以后用QIAquick PCR purification kit(Qiagen)純化;用T7 riboMAX express large scale RNA production system(Promega)將雙鏈cDNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA;然后用RNeasy mini kit(Qiagen)純化;隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄。取2 μg cRNA，用 superscriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶20×108U/L(Invitrogen)，9 random primer進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用QIAquick PCR purification kit(Qiagen)純化;取2 μg cRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，以6 random primer為引物進(jìn)行Klenow標(biāo)記，標(biāo)記產(chǎn)物用QIAquick PCR purification kit(Qiagen)純化，純化后抽干。標(biāo)記過程中 dATP、dCTP、dGTP、dTTP使用濃度為 120 μmol/L，dCTP 使用濃度為 60 μmol/L，Cy5－dCTP、Cy3 －dCTP 使用濃度為 40 μmol/L。在本實驗中，PC－3細(xì)胞的cDNA用Cy5熒光素酶標(biāo)記，PC－3(+)細(xì)胞的cDNA用Cy3熒光素酶標(biāo)記。標(biāo)記的DNA溶于30 μL雜交液中(3×SSC，0.2%SDS，5×Denhart’s，25%甲酰胺)，于42 ℃雜交過夜。雜交結(jié)束后，先在42℃左右含0.2%SDS、2×SSC的液體中洗5 min，而后在0.2×SSC中室溫洗5 min。玻片甩干后即可用于掃描。掃描芯片用ScanArray Express雙通道激光掃描儀(Packard Bioscience)進(jìn)行。采用GenePix Pro 4.0圖像分析軟件(Axon Instruments)對芯片圖像進(jìn)行分析，把圖像信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號;然后對芯片上的數(shù)據(jù)用Lowess方法進(jìn)行歸一化;最后以差異為2倍的標(biāo)準(zhǔn)來確定差異表達(dá)基因。

2.3 RT－PCR檢測 Dicer1 mRNA表達(dá) 根據(jù)Dicer1序列設(shè)計引物，上游引物(F)序列為:5'－CT-CAGCCATGTGAGATTGTG －3'，下游引物(R)序列為:5'－GTCCCAGAACTACCAATACG－3'。用 Trizol一步法提取人前列腺癌PC3細(xì)胞和PC3(+)細(xì)胞總RNA，用隨機(jī)6聚體引物和M－MLV逆轉(zhuǎn)錄酶將細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，以Dicer1 F和 Dicer1 R為引物，PCR擴(kuò)增 Dicer1基因。PCR 條件:94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃20 s，28個循環(huán)，最后72℃ 10 min。

2.4 Western blotting檢測Dicer1蛋白表達(dá) 用細(xì)胞裂解液［50 mmol/L Tris－ HCl(pH8.0)，150 mmol/L NaCl，0.1%SDS，1%NP － 40，100 mg/L PMSF］收集PC3細(xì)胞和PC3(+)細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量后，按30 μg上樣電泳，Westhern blotting檢測Dicer1蛋白表達(dá)，Ⅰ抗為1∶1000稀釋的鼠抗人Dicer1，Ⅱ抗為1∶2000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，以β－actin為內(nèi)參照，加ECL顯色劑顯色，暗室中曝光X光觀察。

2.5 miRNA let－7a－1靶序列－報道基因融合質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)miRBase Targets數(shù)據(jù)庫查找hsa－let7a－1靶序列(UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU)，人工合成其DNA序列及其互補(bǔ)序列，兩端分別加HindⅢ和SacⅠ酶切位點，7a1TF 5'－agcttTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTgagct－3';7a1TR 3'－aACTCCATCATCCAACATATCAAc－5'。等摩爾比混合2條鏈，95℃加熱5 min后，自然冷卻至室溫。將退火雙鏈克隆到pMIR－reportTMluciferase載體中構(gòu)成miRNA let－7a－1靶序列－報道基因融合質(zhì)粒 pMIR－reportlet7a－1T。限制性內(nèi)切酶MluⅠ酶切及測序鑒定陽性重組體。pMIR－reportTMluciferase vector中內(nèi)切酶MluⅠ的切點位于片段插入處HindⅢ和SacⅠ切點之間。

2.6 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染實驗 前列腺癌PC3細(xì)胞和PC3(+)細(xì)胞分別接種于24孔板，用含10%小牛血清、1×105U/L青霉素及1×105U/L鏈霉素的RPMI－1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度﹥80%時，換用無抗生素RPMI－1640培養(yǎng)基，用FuGENE?HD試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞(4復(fù)孔)，每孔1μL FuGENE? HD+0.5 μg pMIR － report－ let7a1T+0.05 μg pMIR － report β － gal control+25 μL opti－MEM。對照組轉(zhuǎn)染等劑量 pMIR－reportTMluciferase空載體。

2.7 熒光素酶活性測定 按試劑盒(Promega)說明進(jìn)行，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS沖洗細(xì)胞1次，加入1×RLB裂解液，放置室溫10 min后，吹打細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液。熒光素酶活性測定:熒光測定管中加100 μL LARⅡ(luciferase assay reagent)，再加細(xì)胞裂解液20 μL，放置發(fā)光儀中，測定pGL3中的firefly熒光素酶活性，讀數(shù)為M1。β－半乳糖苷酶活性測定:30 μL細(xì)胞裂解液+20 μL 1×RLB裂解液+50 μL 2×AB檢測緩沖液，37℃保溫30 min，加150 μL 1 mol/L碳酸鈉終止反應(yīng)，420 nm檢測，計算得到的β－半乳糖苷酶活性為M2。用M1/M2比值表示相對熒光素酶活性。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 芯片結(jié)果

結(jié)果顯示，Dicer1基因在前列腺癌PC3細(xì)胞和PC3(+)細(xì)胞表達(dá)有明顯差異，Cy3/Cy5的比值為3.59，見圖1。

Figure 1.The differential expression of Dicer1 in PC3(+)and PC3 cells detected by gene chip..n=3.*P＜0.05 vs PC3 cells.圖1 基因芯片檢測Dicer1基因在PC3(+)和PC3細(xì)胞中的表達(dá)

2 NKX3.1對Dicer1 mRNA表達(dá)的影響

Dicer1 mRNA在PC3(+)細(xì)胞中表達(dá)較在PC3細(xì)胞的表達(dá)明顯增加，見圖2。

3 NKX3.1對Dicer1蛋白表達(dá)的影響

Dicer1蛋白質(zhì)在PC3(+)細(xì)胞中表達(dá)較在PC3細(xì)胞的表達(dá)明顯增加，見圖3。

4 miRNA let－7a－1靶序列－報道基因融合質(zhì)粒酶切鑒定及測序

人工合成hsa－let7a－1靶序列的DNA序列及其互補(bǔ)序列，2端分別加HindⅢ和SacⅠ酶切位點。退火克隆到pMIR－reportTMluciferase載體中成功構(gòu)成miRNA let－7a－1靶序列－報道基因融合質(zhì)粒pMIR－report－let7a－1T。經(jīng)MluⅠ酶切pMIR－report－let7a－1T和pMIR－reportTMluciferase空載體后，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符，見圖4。

Figure 2.The expression of Dicer1 mRNA in PC3(+)and PC3 cells..n=3.*P＜0.05 vs PC3 cells.M:marker;1:PC3(+)cells 2:PC3 cells.圖2 Dicer1 mRNA分別在PC3(+)和PC3細(xì)胞中表達(dá)

Figure 3.The expression of Dicer1 protein in PC3 cell and PC3(+)cell by Western blotting..n=3.*P＜0.05 vs PC3 cells.1:PC3(+)cells;2:PC3 cells.圖3 Western blotting檢測Dicer1蛋白質(zhì)在PC3(+)和PC3細(xì)胞中表達(dá)

Figure 4.Identification of cloned pMIR －report－let7a－1T by restriction enzyme digestion.M:marker;1:pMIR －reportTMluciferase vector digested by MluⅠ;2:pMIR－report－let7a－1T digested by MluⅠ.圖4 let－7a－1靶序列－報道基因融合質(zhì)粒酶切電泳鑒定

5 成熟miRNA let－7a－1對其靶序列的作用

pMIR－report－let7a－1T轉(zhuǎn)染PC3和PC(+)細(xì)胞后，相對熒光素酶活性(Ml/M2)分別為14.2和6.4，兩者差異顯著(P＜0.05)，表明pMIR－reportlet7a－1T轉(zhuǎn)染PC3(+)細(xì)胞后，NKX3.1上調(diào)Dicer1的表達(dá)，有效促進(jìn)miRNA let－7a－1的成熟。pMIR－reportTMluciferase空載體轉(zhuǎn)染 PC3細(xì)胞和 PC3(+)細(xì)胞后，M1/M2分別為150.4和150.5，兩者沒有明顯差異，見圖5。

Figure 5.The effects of mature let－7a－1 on its target sequence detected by luciferas assay..n=4.*P＜0.05 vs PC3(+)cells in the same group.圖5 熒光素酶活性檢測成熟let－7a－1對靶序列的作用

討 論

NKX3.1是前列腺特異表達(dá)的同源盒基因，受雄激素調(diào)節(jié)，其產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)與功能上屬于核轉(zhuǎn)錄因子［10］，具有抑制前列腺上皮生長及維持分化的作用，與前列腺的發(fā)育成熟以及前列腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［11］。Dicer是RNaseⅢ家族成員，在進(jìn)化上高度保守［12］。Dicer蛋白為一種約200 kD的多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)，含有5個結(jié)構(gòu)域:1個DexH型ATP依賴的N末端解旋結(jié)構(gòu)域;1個PAZ結(jié)構(gòu)域;2個RNaseⅢ結(jié)構(gòu)域;1個dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域［13］。Dicer主要憑借其RNaseⅢ結(jié)構(gòu)域發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn):Dicer1對形成miRNA成熟產(chǎn)物是必需的，其PAZ結(jié)構(gòu)域的作用可能是促進(jìn)Dicer1與miRNA前體分子結(jié)合，對miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默是必不可少的［14］。miRNA分子是一類長約18－25個核苷酸的非編碼小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平通過阻遏局部堿基互補(bǔ)配對的mRNA的翻譯而抑制靶基因的表達(dá)［15］。miRNA的成熟需要經(jīng)歷3個過程:首先在細(xì)胞核中最原始的編碼miRNA的基因組DNA轉(zhuǎn)錄成miRNA的原始轉(zhuǎn)錄物(pri－miRNA)，在Drosha酶作用下生成pre－miRNA;然后pre－miRNA被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì);最后，在細(xì)胞質(zhì)中pre－miRNA在Dicer酶作用下被剪切成雙鏈成熟的miRNA。成熟miRNA通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)結(jié)合，抑制mRNA的翻譯。

本實驗首次報道了NKX3.1上調(diào)Dicer1的表達(dá)，與miRNA的成熟與功能有密切關(guān)聯(lián)。目前研究表明miRNA表達(dá)在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［16］，可以起到“癌基因”或者“抑癌基因”的功能［17］。miRNA let－7a－1 是目前研究最為廣泛的miRNA之一，研究顯示miRNA let－7a－1在前列腺腫瘤中表達(dá)是下調(diào)的，與前列腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。NKX3.1是前列腺特異性同源框基因，目前認(rèn)為NKX3.1為前列腺特異的抑癌基因，它的缺失或突變，可能是前列腺癌發(fā)生和雄激素非依賴等惡性表型的原因［18］。NKX3.1是否通過調(diào)節(jié)Dicer1表達(dá)間接調(diào)控miRNA let－7a－1的功能，從而抑制前列腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展?有待于在大量臨床標(biāo)本中進(jìn)一步實驗研究。同時，本實驗研究也為前列腺癌的治療開辟了新途徑。

［1］Liu W，Zhang P，Chen W，et al.Characterization of two functional NKX3.1 binding sites upstream of the PCAN1 gene that are involved in the positive regulation of PCAN1 gene transcription［J］.BMC Mol Biol，2008，9:45.

［2］Bowen C，Stuart A，Ju JH，et al.NKX3.1 homeodomain protein binds to topoisomerase I and enhances its activity［J］.Cancer Res，2007，67(2):455 －464.

［3］Ouyang X，DeWeese TL，Nelson WG，et al.Loss－offunction of Nkx3.1 promotes increased oxidative damage in prostate carcinogenesis［J］.Cancer Res，2005，65(15):6773－6779.

［4］Ye X，Liu Q.Expression，purification，and analysis of recombinant Drosophila Dicer－1 and Dicer－2 enzymes［J］.Methods Mol Biol，2008，442:11 －27.

［5］Jin L，Kryukov K，Suzuki Y，et al.The evolutionary study of small RNA－directed gene silencing pathways by investigating RNase Ⅲ enzymes［J］.Gene，2009，435(1 －2):1－8.

［6］Skaftnesmo KO，Prestegarden L，Micklem DR，et al.MicroRNAs in tumorigenesis［J］.Curr Pharm Biotechnol，2007，8(6):320 －325

［7］Roush S，Slack FJ.The let－ 7 family of microRNAs［J］.Trends Cell Biol，2008，18(10):505 －516.

［8］Shi XB，Tepper CG，White RW.MicroRNAs and prostate cancer［J］.Cell Mol Med，2008，12(5A):1456 －1465.

［9］劉聞聞，于春曉，崔福愛，等.人同源盒基因NKX3.1對前列腺癌細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用［J］.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2006，22(12):996－1002.

［10］Holmes KA，Song JS，Liu XS，et al.NKX3.1 and LEF.1 function as transcriptional inhibitors of estrogen receptor activity［J］.Cancer Res，2008，68(18):7380 －7385.

［11］Asatiani E，Huang WX，Wang A，et al.Deletion，methylation，and expression of the NKX3.1 suppressor gene in primary human prostate cancer［J］.Cancer Res，2005，65(4):1164－1173.

［12］Forman JJ，Legesse－Miller A，Coller HA.A search for conserved sequences in coding regions reveals that the let－7 microRNA targets Dicer within its coding sequence［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(39):14879－14884.

［13］Peng JJ，Yan F，Chen HR，et al.Progress of studies on Dicer structure and function［J］.Yi Chuan，2008，30(12):1550－1556.

［14］Lee H，Lee HS，Yoon SY，et al.Contributions of 3'－overhang to the dissociation of small interfering RNAs from the PAZ domain:molecular dynamics simulation study［J］.Mol Graph Model，2007，25(6):784 －793.

［15］Ramiro G，Muller F，Amellia C，et al.MicroRNA expression and function in cancer［J］.Trends Mol Med，2006，12(12):580－587.

［16］曲昌菊，王旭丹，楊惠玲，等.相同遺傳背景下同輻射抗拒鼻咽癌細(xì)胞miRNA差異表達(dá)的研究［J］.中國病理生理雜志，2009，25(3):484 －488.

［17］Finoux AL，Chartrand P.Oncogenic and tumour suppressor microRNAs［J］.Med Sci(Paris)，2008，24(12):1049－1054.

［18］Wang P，Ma Q，Luo J，et al.NKX3.1 and p27(KIP1)cooperate in proliferation inhibition and apoptosis induction in human androgen－independent prostate cancer cells［J］.Cancer Invest，2009，27(4):369 －375.