賈 青， 張維東， 王朝霞， 王兆朋， 張?jiān)掠ⅲ?張俊平

(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)病理研究室，山東 濟(jì)南 250062)

長期大量飲酒可造成脂肪肝、肝功能損害，并最終形成肝硬化，給人們的健康帶來很大的危害，因此越來越受到人們的關(guān)注。目前認(rèn)為乙醇誘導(dǎo)形成肝纖維化存在多種機(jī)制，肝組織中星形細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)的活化是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)，標(biāo)志之一是 α－平滑肌肌動(dòng)蛋白(α－smooth muscle actin，α－SMA)在 HSCs細(xì)胞中的過度表達(dá)［1－3］。關(guān)于過量飲酒與長期少量飲酒導(dǎo)致肝纖維化機(jī)制的異同，相關(guān)文獻(xiàn)很少。據(jù)Carson等［4］研究報(bào)道，大鼠在每日攝入乙醇(3－4)g·kg－1時(shí)行為無異常，(6－7)g·kg－1時(shí)出現(xiàn)嚴(yán)重的共濟(jì)失調(diào)，這一劑量區(qū)間含蓋了酗酒人群典型的行為表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)采用3 g·kg－1和8 g·kg－12種劑量乙醇誘導(dǎo)形成早期肝纖維組織增生，通過檢測Toll樣受體4(Toll like receptor－4，TLR－4)、α －SMA 轉(zhuǎn)化生長因子 β(transforming growth factor－β，TGF－β)、核因子 －κB(nuclear factor－kappa B，NF－κB)蛋白表達(dá)、骨形成蛋白和激活素的跨膜抑制劑(BMP and activin membrane－bound inhibitor，Bambi)mRNA 表達(dá)及細(xì)胞凋亡指數(shù)的變化，探討不同通路在不同劑量乙醇誘導(dǎo)肝纖維化過程中的作用及相互關(guān)系。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物 清潔級雄性昆明種小鼠24只，3周齡，體重18－22 g，購自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。隨機(jī)分為正常對照組、高劑量乙醇組、低劑量乙醇組，每組8只。喂養(yǎng)條件:室溫 (24±3)℃，濕度30% －45%。所用飼料:康大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飼料，許可證號(hào)為魯飼準(zhǔn)證字364號(hào)。

1.2 藥物及試劑 無水乙醇(分析純級)天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心生產(chǎn)，批號(hào)20050802，許可證號(hào)為XK13－201－00144，蒸餾水稀釋;TLR－4、α－SMA、TGF－β、NF－κB蛋白檢測所用Ⅰ抗為兔抗小鼠多克隆抗體，購自Biolegend;Ⅱ抗為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)偶聯(lián)羊抗兔IgG，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;TUNEL原位凋亡檢測試劑盒為羅氏公司產(chǎn)品;超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒(BeyoECL Plus)購自碧云天生物技術(shù)研究所;總RNA提取試劑盒為Invitrogen Trizol reagent;實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ及反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent kit均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 酶標(biāo)儀:Bio－Rad Model 680;病理切片機(jī):Leica RM2235;低溫高速離心機(jī):Beckman AllegraTM64R Centrifuge;光學(xué)顯微鏡:Leica DM4000B;定量PCR儀:ABI 7500型熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀。

2 方法

2.1 乙醇誘導(dǎo)早期肝纖維化模型的建立 參考Carson等［4］和李舒丹等［5］方法。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，高劑量乙醇組給予乙醇(5g·kg－1·d－1)，并在1周內(nèi)逐漸增大至8 g·kg－1·d－1，低劑量乙醇組給予乙醇劑量為3 g·kg－1·d－1，正常對照組給予等量生理鹽水溶液，均為經(jīng)口灌胃，自由進(jìn)食進(jìn)水。每周稱重2次，各組小鼠按乙醇灌胃量達(dá)到預(yù)定劑量后30 d處死，死亡小鼠隨時(shí)補(bǔ)充。摘除眼球取血約1 mL，快速取肝組織，冰浴生理鹽水輕輕沖洗后，部分肝組織放入10%甲醛固定液中，另取一部分肝組織快速放入－80℃低溫保存。肝組織固定24 h后，常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片，備組織病理學(xué)觀察。

2.2 常規(guī)HE染色 光鏡下病理組織學(xué)觀察，參照2000年修訂的病毒性肝炎防治方案［6］，對炎癥及纖維化程度進(jìn)行分級和分期。

2.3 常規(guī)Masson染色 膠原纖維組織標(biāo)記為綠色，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)200倍視野，Leica QwinV3圖像分析系統(tǒng)計(jì)算每個(gè)視野膠原纖維面積。

2.4 采用免疫組織化學(xué)法檢測TLR－4、α－SMA蛋白表達(dá) Ⅰ抗稀釋濃度1∶100，微波熱抗原修復(fù)。肝組織脫水、石蠟包埋、4 μm切片、脫蠟、至水、抗原修復(fù)、羊血清封閉抗原、滴加Ⅰ抗、4℃孵育過夜、HRP偶聯(lián)羊抗兔IgG、37℃孵育1 h、鏡下二氨基聯(lián)苯胺(DAB)控制顯色、細(xì)胞核復(fù)染、脫水、透明、中性樹膠封片。每張切片選取10個(gè)高倍視野，Image－Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算著色區(qū)域積分吸光度值。

2.5 TUNEL原位凋亡檢測 嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒使用說明操作，陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞核為黃褐色著色。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)400倍視野計(jì)算凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)。

2.6 Western blotting檢測TGF、NF－кB 蛋白表達(dá)Ⅰ抗稀釋濃度1∶500。組織勻漿提取總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法(Bradford)檢測蛋白濃度;十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺(SDS－PAGE)凝膠電泳;200 mA，轉(zhuǎn)膜1 h;5%封閉液封閉1 h;Ⅰ抗4℃過夜;Ⅱ抗室溫孵育1 h;TBS液清洗;ECL化學(xué)發(fā)光，暗室X光片顯影、定影;將X光片掃描，并用Image－Pro Plus 6.0軟件計(jì)算各條帶的積分吸光度值(IA)。

2.7 實(shí)時(shí)定量PCR檢測Bambi mRNA含量 Bambi上游引物序列為5'－GGGCACTAATCAGATACCCT－3'，下游引物序列為 5'－AAAGTGACCTGAAATTCGCAAA－3'。內(nèi)參照 β－actin的上游引物為5'－GCACCACACCTTCTACAATGAG－3'，下游引物為5'－CAGAGGCATACAGGGACAGC －3'，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。抽提組織總RNA，按照Trizol試劑盒說明操作;反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，按試劑說明配制10 μL逆轉(zhuǎn)錄體系，37 ℃15 min，85 ℃5 s;實(shí)時(shí)熒光定量PCR，按照試劑盒說明配制20 μL PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為:預(yù)變性95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。Ct值表示目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到設(shè)定閾值經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。參考文獻(xiàn)［7］計(jì)算△Ct=Ct(Bambi)－Ct(β－actin)，△△Ct=［Ct(Bambi)－Ct(β －actin)］乙醇處理組－［Ct(Bambi)－Ct(β －actin)］正常對照組，采用相對定量法計(jì)算各組2－△△Ct。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 肝組織形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果

對照組肝細(xì)胞呈多角形，排列規(guī)整，大小正常，細(xì)胞核1－2個(gè)居中排列。大劑量乙醇組，肝細(xì)胞體積縮小，胞質(zhì)內(nèi)可見大量小的空泡狀結(jié)構(gòu)，肝竇間隙增大，匯管區(qū)靜脈充血明顯，膽小管管腔狹窄，部分區(qū)域可見炎性壞死灶，Masson染色可見膠原組織增生明顯;小劑量乙醇組，肝細(xì)胞氣球樣變性，細(xì)胞體積明顯增大，竇間隙消失，偶見灶性壞死，Masson染色顯示膠原組織增生，見圖1、2。乙醇誘導(dǎo)組炎癥活動(dòng)度及纖維化程度均高于對照組(P＜0.05)，見表1。

Figure 1.The hematoxylin－feosin staining showed the hepatic cells presented ballooning degeneration in low dose group(B)，but in high dose of alcohol group(C)the hepatic cells became diminution and the hepatic sinusoid expanded and were full of erythrocytes(×200).A:control;B:low dose of alcohol(3 g·kg－1·d－1);C:high dose of alcohol(8 g·kg－1·d－1).圖1 蘇木素－伊紅染色

Figure 2.Masson staining showed the areas of collagen fibers increased in the mice treated with alcohol and those of mice treated with alcohol at a high dose were more obviously(×200).A:control;B:low dose of alcohol;C:high dose of alcohol.圖2 Masson染色顯示乙醇誘導(dǎo)組肝膠原纖維增生，高劑量組增生更為明顯

表1 炎癥分級及纖維化分期結(jié)果Table 1.The inflammation grade and fibration staging(n=8)

2 膠原纖維面積檢測結(jié)果

乙醇誘導(dǎo)組膠原纖維面積與對照組比較差異顯著(P＜0.01)，高劑量組膠原纖維面積增生最為顯著，見表2。

表2 Masson染色膠原纖維面積計(jì)算結(jié)果Table 2.The collagen fiber areas were quantified based on 10 magnification fields(×200)per liver Masson－staining section by the software of Leica QWinV3(.n=8)

表2 Masson染色膠原纖維面積計(jì)算結(jié)果Table 2.The collagen fiber areas were quantified based on 10 magnification fields(×200)per liver Masson－staining section by the software of Leica QWinV3(.n=8)

＊＊P ＜0.01 vs control group.

Group Areas of collagen fibre per visual field(μm2)Control 1126.21 ±393.34 Low dose of alcohol 7551.05 ±1708.80＊＊High dose of alcohol 11751.90 ±2167.20＊＊

3 免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果

TLR－4蛋白在小劑量組較對照組表達(dá)明顯增多，在高劑量組表達(dá)減少;α－SMA蛋白在正常組只表達(dá)于血管平滑肌中，其它部位未見表達(dá)，乙醇誘導(dǎo)組除血管壁外，竇隙中星形細(xì)胞也表達(dá)SMA蛋白，且高劑量組表達(dá)更為明顯，見圖3。各組積分吸光度值見表3。

表3 各組TLR－4、α－SMA積分吸光度值比較Table 3.The comparison of integral absorbance of TLR －4 and α－SMA among groups(.n=8)

表3 各組TLR－4、α－SMA積分吸光度值比較Table 3.The comparison of integral absorbance of TLR －4 and α－SMA among groups(.n=8)

＊＊P ＜0.01 vs control group.

Control 945868.00 ±13931.78 328.91 ±26.95 Low dose of alcohol 1492518.30 ±52925.59＊＊ 84547.01 ±1003.33＊＊High dose of alcohol 403218.91 ±6766.95＊＊ 194410.47 ±2169.26＊＊

Figure 3.Expression of TLR －4 and α －SMA in the liver with immunohistochemistry.TLR －4 is up－regulated in low dose group but decreases in high dose group(×200);α－SMA increases in alcohol－treated groups，but it increases more obviously in high dose group(×400).圖3 免疫組織化學(xué)法檢測TLR－4、α－SMA蛋白表達(dá)

4 Western blotting檢測結(jié)果

TGF－β、NF－κB蛋白含量在高劑量乙醇誘導(dǎo)組中升高最為顯著，在低劑量組中也明顯升高，見圖4。各組條帶積分吸光度值與內(nèi)參照蛋白積分吸光度值比值見圖5。

Figure 4.Determination of TGF－β，NF－κB and β －actin protein expression in liver tissue by Western blotting.圖4 免疫印跡法檢測各組TGF－β、NF－кB及β－actin在肝組織中的表達(dá)

表4 各組凋亡細(xì)胞數(shù)比較Table 4.The apoptotic nuclei number in liver of mice in each group(.n=8)

表4 各組凋亡細(xì)胞數(shù)比較Table 4.The apoptotic nuclei number in liver of mice in each group(.n=8)

＊＊P ＜0.01 vs control group.

Control 0.67 ±0.14 Low dose of alcohol 4.83 ±0.71＊＊High dose of alcohol 9.26 ±1.03＊＊

Figure 5.Relative protein expression was quantified by the band absorbance against β－actin..n=8.*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.圖5 蛋白條帶與β－actin積分吸光度比值

5 原位凋亡檢測結(jié)果

乙醇誘導(dǎo)組凋亡細(xì)胞數(shù)較正常對照組明顯增多，其中高劑量乙醇組細(xì)胞凋亡數(shù)最高，見圖6、表4。

表5 各組Bambi mRNA相對含量比較Table 5.Bambi mRNA relative content in each group(.n=8)

表5 各組Bambi mRNA相對含量比較Table 5.Bambi mRNA relative content in each group(.n=8)

*P ＜0.05 vs low dose group.

Group Ct(Bambi) Ct(β－actin) 2－△△Ct Control 34.5342±2.1210 28.9209±0.2579 Low dose of alcohol 32.3696±1.1682 28.8062±0.2012 4.1408±0.5314 High dose of alcohol 33.6458±1.5279 28.8312±0.1815 1.7400±0.4082*

Figure 6.Effects of different doses of alcohol on cell apoptosis in liver.Apoptotic nuclei in the liver was measured by the terminal deoxyribonucleotidy1 transferase－mediated dUTP nick－end labeling(TUNEL，×400).A:control;B:low dose of alcohol;C:high dose of alcohol.圖6 TUNEL檢測乙醇對各組肝組織細(xì)胞凋亡的影響

6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果

低劑量乙醇組Bambi mRNA的含量約為正常對照組的4.14倍，高劑量乙醇組Bambi mRNA含量較低劑量組顯著降低，見表4。

討 論

肝纖維化是長期大量飲酒造成肝硬化的必然病理過程，酗酒者顯然較長期少量飲酒者形成肝纖維化的危險(xiǎn)性更高，但二者機(jī)制上是否存在差異目前研究不多。近年來TLR－4通路在肝纖維化中的研究越來越深入［8］，自從1997年Medzhitow首先報(bào)道人類TLR以來，這一家族目前共有11個(gè)成員，TLR－4是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的人類TLR，主要功能為介導(dǎo)病原體細(xì)胞表面內(nèi)毒素/脂多糖(LPS)的識(shí)別和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在肝內(nèi)主要存在于庫普弗細(xì)胞(Kupffer cells，KCs)及HSCs表面。肝臟為腸源性內(nèi)毒素主要靶器官，酒精性肝硬化患者血液中LPS濃度顯著增高［9］，LPS結(jié)合LPS結(jié)合蛋白 (LPS－binding protein，LBP)后在CD14幫助下，通過TLR－4與髓樣細(xì)胞分化蛋白2(myeloid differentiaton protein－2，MD－2)形成的復(fù)合體，啟動(dòng)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終激活NF－κB，通過調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生大量腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor－α，TNF－α)、氧自由基、TGF－β等活性分子，直接或間接激活HSCs，導(dǎo)致肝纖維化的形成。TGF－β是調(diào)控肝星形細(xì)胞活化的重要細(xì)胞因子［10］，它不僅能夠誘導(dǎo)靜止型的HSCs轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂性鲋承院统衫w維性的肌成纖維樣細(xì)胞(myofibroblast，MFB)［11］，刺激細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，EMC)表達(dá)，通過調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)及上調(diào)MMP組織抑制因子(issue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)降低 EMC 的降解［12，13］，促進(jìn)肝纖維化的產(chǎn)生，而且能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡［14］。體外實(shí)驗(yàn)表明巨噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞后促進(jìn)了TGF－β的轉(zhuǎn)錄翻譯［15］，提示凋亡與纖維組織增生也有著密切關(guān)系。2007年Seki等［16］研究發(fā)現(xiàn)TLR－4是通過下調(diào)TGF－β偽受體Bambi增強(qiáng)了HSCs對TGF－β的敏感性，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生，其中NF－κB抑制劑IκBsr完全抑制了LPS誘導(dǎo)的Bambi的下調(diào)，減少了TGF－β介導(dǎo)的膠原纖維的生成，說明NF－κB在肝纖維化中具有十分重要的作用。

本實(shí)驗(yàn)對不同劑量乙醇誘導(dǎo)的小鼠分別檢測了TLR－4、TGF－β、α－SMA、NF－κB蛋白含量的變化，以及凋亡細(xì)胞數(shù)量的變化。結(jié)果顯示2種劑量乙醇均誘導(dǎo)肝內(nèi)膠原纖維明顯增生，高劑量組(8 g·kg－1·d－1)增生更加顯著;另外大劑量組TGF－β、α－SMA、NF－κB蛋白較小劑量組含量更高，而高劑量組中TLR－4在KCs中的表達(dá)受到抑制，在低劑量組(3 g·kg－1·d－1)表達(dá)明顯升高。對各組凋亡細(xì)胞的檢測發(fā)現(xiàn)，2組乙醇誘導(dǎo)小鼠肝組織細(xì)胞凋亡率明顯升高，高劑量組細(xì)胞凋亡數(shù)明顯高于低劑量組。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明雖然TLR－4通路及凋亡機(jī)制在肝纖維化過程中都占據(jù)著重要位置，但酗酒造成肝組織內(nèi)更多的細(xì)胞凋亡是纖維化程度更為嚴(yán)重的直接因素，酗酒小鼠肝組織內(nèi)TLR－4蛋白表達(dá)及Bambi mRNA含量下調(diào)說明Bambi通路存在不依賴于TLR－4的另外的調(diào)控機(jī)制，這一機(jī)制是否與凋亡有關(guān)，則還需做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

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