李良軍， 趙元錳， 張燦斌， 張 克， 王光華

賁門癌是我國常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中位于前列。目前雖然在賁門癌的早期診斷與綜合治療方面取得較大進展，但大多數(shù)中晚期患者綜合治療后的5年生存率仍不超過24%［1］。導致患者死亡的主要原因是腫瘤細胞的擴散與轉移，約有45%的患者死于轉移、復發(fā)。探討腫瘤轉移相關基因，分析其與賁門癌生物學行為的相關性有重要的臨床意義。賁門癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素和多階段演變的過程，該過程與多種原癌基因激活及抑癌基因失活，腫瘤轉移抑制基因失活相關［2］。

nm23是第一個被分離出來的腫瘤轉移抑制基因。nm23-H1基因是nm23基因家族成員之一，與人類惡性腫瘤侵襲轉移關系較密切，其表達水平與多種腫瘤轉移行為和預后相關［3］?；|金屬蛋白酶家族(MMPs)中的MMP-2被認為是參與降解基底膜(BM)和細胞外基質(ECM)，影響組織的重塑并促進腫瘤的浸潤、轉移和血管生成的主要成分［4］。本研究采用免疫組化SP法聯(lián)合檢測腫瘤轉移抑制基因nm23-H1和基質金屬蛋白酶MMP-2在賁門癌中的表達，探討nm23-H1和MMP-2與賁門癌的浸潤、轉移、臨床病理分期的關系，為賁門癌的臨床防治提供科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標本收集及制作 收集2005—2009年河南科技大學第一附屬醫(yī)院手術切除并經(jīng)病理確診的賁門癌57例資料。全部病例臨床資料完整。賁門癌病例的腫瘤中心均位于齒狀線上1 cm至齒狀線下2 cm范圍內，符合Siewert賁門癌的分型標準［5］。男39例，女18例;年齡32～78歲，平均63.8歲;高分化腺癌14例，中分化腺癌21例，低分化腺癌22例;淋巴結轉移陽性32例，淋巴結轉移陰性25例。所有病例術前均未經(jīng)放化療。另外收集正常賁門黏膜25例作為對照組。全部標本均經(jīng)10%福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片，分別進行常規(guī)HE染色和免疫組化染色。實驗所用試劑nm23-H1單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，MMP-2單克隆抗體及SP試劑盒、DAB顯色劑等均購自北京中杉金橋生物工程有限公司。

1.2 實驗方法 采用免疫組化SP法檢測賁門組織中nm23-H1和MMP-2表達情況。將組織切片經(jīng)過二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水后，用檸檬酸鹽緩沖液高壓熱修復抗原，嚴格按照試劑盒說明的步驟操作，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封固玻片。用PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 結果判斷 在正常賁門黏膜及賁門癌組織中nm23-H1和MMP-2陽性表達均定位于細胞漿內，呈棕黃色顆粒樣物質。高倍鏡下(×400)隨機選取10個視野，按細胞染色的百分率及染色的深淺程度采用二級計分法判定陽性結果。(1)細胞染色率＜10%為0分，10% ～25%為1分，25% ～50%為2分，50% ～75%為3分，＞75%記為4分;(2)按染色的深淺程度計分:無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。二者計分相乘數(shù)值＞1者判定為陽性［6］。

1.4 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進行分析，數(shù)據(jù)資料用χ2檢驗和Fisher精確概率法計算，相關性采用Spearman等級相關分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 正常賁門黏膜與賁門癌組織中nm23-H1和MMP-2的陽性表達 nm23-H1陽性表達呈顆粒狀定位于細胞漿中，淺黃色至棕黃色。比較正常賁門黏膜及賁門癌組織中nm23-H1的陽性表達率，前者明顯高于后者(23/25 vs.14/57)，二者具有顯著差異性(χ2=31.918，P ＜0.01);MMP-2 陽性著色呈顆粒狀定位于細胞漿，黃色至棕黃色。MMP-2在正常賁門黏膜中的陽性表達率明顯低于賁門癌組織(5/25 vs.42/57)，有顯著差異性(χ2=20.472，P ＜0.01)。見表1。

表1 正常賁門黏膜與賁門癌組織中nm23-H1和MMP-2的陽性表達率

2.2 MMP-2和nm23-H1在賁門癌中的表達與臨床病理指標的關系 MMP-2的陽性表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及組織學分級相關(P＜0.05，P＜0.01，P ＜ 0.01)，與年齡、性別無關(P ＞ 0.05);nm23-H1蛋白表達與腫瘤浸潤深度及淋巴結轉移密切相關(P ＜0.01，P ＜0.05)，與性別、年齡及組織學分級無相關性(P＞0.05)。見表2。

表2 nm23-H1和MMP-2在賁門癌組織中的陽性表達與病理參數(shù)間的關系

2.3 nm23-H1和MMP-2在賁門癌組織中陽性表達的相關性分析 nm23-H1陽性表達的14例中MMP-2陽性占4例，nm23-H1陰性表達的43例中MMP-2陽性占38例;MMP-2蛋白陽性表達的42例中nm23-H1陽性4例，MMP-2陰性表達的15例中nm23-H1陽性占10例;二者均陰性共5例。nm23-H1與MMP-2陽性表達率呈顯著負相關，兩者差異具有統(tǒng)計學意義(r= － 0.585，χ2=19.478，P ＜0.01)，見表3。

表3 nm23-H1和MMP-2在賁門癌組織中的表達關系

3 討論

腫瘤的發(fā)生與癌基因和抑癌基因的異常關系密切，但在腫瘤浸潤轉移這一特定階段，涉及到轉移促進基因和轉移抑制基因表達異常。nm23是第一個被發(fā)現(xiàn)的腫瘤轉移抑制基因，nm23-H1是nm23腫瘤抑制基因家族中的代表，與腫瘤轉移的抑制關系十分密切。定位于17號染色體長臂(17q22)，主要表達產(chǎn)物為二磷酸核苷激酶(NDPK)，參與體內磷酸核苷的生成，通過影響微管聚合狀態(tài)參與G蛋白的信號傳遞和微管聚合酶的活化而調節(jié)細胞代謝，在腫瘤細胞增殖、分化和侵襲轉移中起重要作用，其活性與腫瘤細胞轉移及增生過程有關［7］。nm23-H1的表達與乳腺癌、肺癌、肝癌、食管癌、惡性黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤的高轉移潛能顯著負相關，被認為是顯著的轉移抑制基因［8］。但是由于腫瘤轉移過程中信號轉導途徑的復雜性及調控的網(wǎng)絡性，nm23-H1表達水平雖可對判斷某些腫瘤浸潤深度及淋巴結轉移起重要參考作用，但其在臨床診斷中尚不能作為腫瘤獨立的綜合預后因子［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，正常賁門黏膜與賁門癌組織相比，nm23-H1陽性表達率明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，提示nm23-H1具有一定抑制腫瘤轉移的活性，其表達的缺失可能引起腫瘤的轉移，使腫瘤細胞侵襲力更強。

基質金屬蛋白酶(MMPs)是一類依賴鋅離子的內肽酶，屬重要的蛋白水解酶類，經(jīng)典型MMP以水溶性酶原形式被分泌至胞外，在激活劑的作用下脫去前肽而具有蛋白水解酶活性，通常由內皮細胞、巨噬細胞、粒細胞及結締組織細胞分泌，能降解細胞外基質(ECM)及基底膜(BM)類纖維膠原，在腫瘤的浸潤與轉移過程中起重要作用。MMP-2是MMPs家族重要成員之一，分子量72 KD，激活后的MMP-2能降解ECM及BM中的Ⅳ型、Ⅴ型膠原和纖維連接蛋白成分，導致基底膜破壞，腫瘤細胞浸潤結締組織基質，侵入小血管和淋巴管而發(fā)生轉移［10］。關于MMP-2與腫瘤浸潤、轉移的關系國內外已有大量的實驗研究，原位雜交技術揭示了結腸癌間質細胞能合成MMP-2，并與癌細胞共同參與浸潤癌特異性組織重塑和基底膜降解過程［11］。本研究結果顯示MMP-2在正常賁門黏膜組織中陽性表達率較低，而在賁門癌組織中陽性表達率較高，兩者差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，且與賁門癌的浸潤深度、淋巴結轉移及組織學分級密切相關(P＜0.05)，提示其表達增高能促進賁門癌的浸潤與轉移。

本實驗結果還顯示，在賁門癌組織中nm23-H1與MMP-2的表達兩者之間存在顯著負相關(r=－0.585，P ＜0.01)，nm23-H1 的低表達提示其抑癌基因功能的缺失，進而導致腫瘤細胞信號傳導異常，并進一步促使MMP-2基因的轉錄表達增高，導致BM與ECM降解，加速賁門癌細胞的侵襲轉移。隨著腫瘤浸潤程度的加深與淋巴結轉移的進展，nm23-H1陽性表達率減低，MMP-2的陽性表達率增高，這與腫瘤的臨床病理分期密切相關，提示二者的表達可能為復雜腫瘤信號轉導調控網(wǎng)絡的組成部分，前者屬上游調控基因［12］，其詳細機制有待進一步研究。聯(lián)合對nm23-H1與MMP-2蛋白表達的檢測可能成為臨床判斷賁門癌分化及浸潤轉移潛能的重要參考指標，并提示其早期診斷的可能。

［1］ de Manzoni G，Pedrazzani C，Pasini F，et al.Results of surgical treatment of adenocarcinoma of the gastric cardia［J］.Ann Thorac Surg，2002，73(4):1035-1040.

［2］ Rugge M，Cassaro M，Di Mario F，et al.The long term outcome of gastric non-invasive neoplasia［J］.Gut，2003，52(8):1111-1116.

［3］ Baba H，Urano T，Okada K，et a1.Two isotypes of murine nm23/nucleoside diphosphate kinase，nm23-M1 and nm23-M2，are involved in metastatic suppression of a murine melanoma line［J］.Cancer Res，1995，55(9):1977-1980.

［4］ 宋牧，倪多，朱麗萍.VEGF、MMP-2在乳腺癌中的表達及其臨床意義［J］.新疆醫(yī)科大學學報，2008，31(1):57-59.

［5］ Siewert JR，Stein HJ.Carcinoma of the gastroesophageal junction classification，pathology and extent of resection［J］.Dis Esophagus 1996，9:173-182.

［6］ Lu CD，Altieri DC，Tanigawa N.Expression of a novel antiapoptosis gene，survivin，correlated with tumor cell apoptosis and p53 accumulation in gastric carcinomas［J］.Cancer Res，1998，58(9):1808-1812.

［7］ Chen JQ，Zhan WH，He YL，et a1.Expression of heparanase gene，CD44v6，MMP-7 and nm23 protein and their relationship with the invasion and metastasis of gastric carcinomas［J］.World J Gastroenterol，2004，10(6):776-782.

［8］ Lacombe ML，Milon L，Munier A，et al.The human nm23/nucleoside dispaosphate kinases［J］.Bioenerg Biomembr，2000，32(3):247-258.

［9］ 王亞莉，王建剛，劉琳.食管鱗癌nm23-H1及基質金屬蛋白酶-7蛋白表達的臨床病理意義［J］.新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報，2008，25(1):23-26.

［10］ Okada E，Murai Y，Matsui K，et al.Survivin expression in tumor cell nuclei is predictive of a favorable prognosis in gastric cancer patients［J］.Cancer Lett，2001，163(1):109-116.

［11］ 黃啟普，耿排力，呂同德，等.胃癌組織中survivin、MMP-2及nm23的表達及其臨床意義［J］.青海醫(yī)學院學報，2006，27(1):1-4.

［12］ Zhou Q，Yang X，Zhu D，et a1.Double mutant P96S/S120G of Nm23-H1 abrogates its NDPK activity and motility-suppressive ability［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，356(2):348-353.