陸 波， 肖獻(xiàn)秋， 洪 巖， 高 興， 張國(guó)強(qiáng)， 周鳳英， 董 曉， 龔偉達(dá)

胃癌是全世界第4大常見(jiàn)腫瘤和第2位常見(jiàn)腫瘤死因，2002年新發(fā)胃癌病例達(dá)934 000，每年死亡人數(shù)達(dá)700 000［1］。大約2/3病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家，其中中國(guó)占42%［1］。在我國(guó)，胃癌的發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤之首，每年死于胃癌的患者多達(dá) 16 萬(wàn)人［2］。

胃癌的發(fā)生發(fā)展與其他許多惡性腫瘤一樣，也是多基因、多因素參與的多步驟、多階段的復(fù)雜過(guò)程。近年來(lái)研究表明，DNA損傷的堿基錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair，MMR)通路基因的突變也參與了腫瘤的發(fā)病機(jī)制，并且可能是腫瘤發(fā)生的早期分子事件。MMR通路中最常發(fā)生突變的基因是hMSH2和hMLH1。hMSH2基因IVS12-6T＞C多態(tài)性位點(diǎn)位于第13外顯子內(nèi)含子剪接受體位點(diǎn)的上游第6位核苷酸。內(nèi)含子位點(diǎn)的多態(tài)性可能影響RNA剪接，從而改變?cè)摶虻鞍椎谋磉_(dá)，導(dǎo)致攜帶不同該基因型的個(gè)體對(duì)疾病易感性的差異。研究報(bào)道［3-4］，hMSH2IVS12-6T＞C多態(tài)與許多腫瘤的發(fā)生有關(guān)，如肺癌、霍奇金淋巴瘤等，但尚未見(jiàn)該位點(diǎn)與胃癌遺傳易感性的關(guān)聯(lián)性研究報(bào)道。我們推測(cè)，hMSH2基因多態(tài)變異可能與胃癌遺傳易感性存在關(guān)聯(lián)。基于此，本研究采用TaqMan MGB探針對(duì)hMSH2基因IVS12-6T＞C多態(tài)進(jìn)行基因分型，以探討其與胃癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，該研究將對(duì)進(jìn)一步揭示胃癌的遺傳學(xué)機(jī)制具有重要的意義，也為今后實(shí)施胃癌的個(gè)體預(yù)防和治療提供一定依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

隨機(jī)收集自2006年3月至2010年2月宜興市人民醫(yī)院住院并經(jīng)病理確診的胃癌患者以及住院的非胃癌患者。病例組552例，其中男性377例，女性175例，平均年齡63.0歲( ±9.9歲);對(duì)照組592例(年齡、性別均相匹配)，其中男性391例，女性201例，平均年齡63.4歲(±10.4歲)。中位年齡均為63.0歲。所有患者術(shù)前均未行化療或放療。病例組和對(duì)照組均完成問(wèn)卷調(diào)查并愿意提供10 mL新鮮外周血，所有血樣在6 h內(nèi)保存于－20℃冰箱。吸煙者指每天至少1支，連續(xù)半年以上;飲酒者指每周至少1次，持續(xù)1年以上。胃癌臨床病理學(xué)特征:組織學(xué)分型采用Lauren分型［5］。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用酚-氯仿法提取基因組DNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的量，瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA的完整性。

1.2.2 基因分型 采用Taqman MGB探針?lè)椒▽?duì)hMSH2基因IVS12-6T＞C多態(tài)進(jìn)行基因分型。分型原理:不同的等位基因?qū)?yīng)不同的熒光，等位基因T對(duì)應(yīng)FAM熒光，C對(duì)應(yīng)HEX熒光，根據(jù)兩種熒光的不同Ct值區(qū)分出不同的基因型(如圖1所示)。對(duì)于分散的點(diǎn)，根據(jù)擴(kuò)增曲線來(lái)判斷基因型。同時(shí)抽取10%的樣本采用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果相一致。引物及探針均由南京驥驁生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)及合成。上游引物為5'-GAA TAT ATG TTG ATT TAC CTC CCA TAT TG-3'，下游引物為5'-CAA TCC ATT TAT TAG TAG CAG AAA GAA GTT-3';TaqMan探針1 為5'-FAM-CCT ACA AAA CAA ATT AP-3'，探針2為5'-HEX-CCT ACA GAA CAA ATT AP-3'(其中P代表TaqMan-MGB基團(tuán))。10 μL PCR反應(yīng)體系包括 ddH2O 2.8 μL，Realtime Probe qPCR Mix 5 μL，正反義引物各0.3 μL，TaqMan 探針1 及2 各0.2 μL，50 × Rox reference dye 0.2 μL，模板 DNA 1 μL。PCR反應(yīng)程序包括預(yù)變性95℃ 10 min，變性95℃15 s，退火及延伸60℃ 1 min，共45個(gè)循環(huán)，儀器自動(dòng)收集熒光信號(hào)，SDSV1.3.2軟件分析給出基因分型結(jié)果。

圖1 等位基因分型圖

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以擬合優(yōu)度 χ2檢驗(yàn)分析hMSH2IVS12-6T＞C多態(tài)各基因型在對(duì)照組中分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，以確認(rèn)研究樣本的群體代表性。χ2檢驗(yàn)比較研究人群年齡、性別、吸煙、飲酒等因素頻數(shù)分布差異。單因素及多因素Logistic回歸計(jì)算比值比(odds ratios，ORs)及其95%可信區(qū)間(confidence intervals，CIs)，分析各基因型與胃癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性，并對(duì)年齡、性別、吸煙及飲酒進(jìn)行分層分析。采用SAS9.1統(tǒng)計(jì)軟件(SAS Institute，Cary，NC)，所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究群體的基本特征

病例組和對(duì)照組的基本信息如表1所示:病例組和對(duì)照組在性別與年齡頻數(shù)分布上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為 0.456和 0.200)。病例組吸煙者(45.0%)和飲酒者(33.3%)高于對(duì)照組吸煙者(29.4%)和飲酒者(25.0%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值分別為＜0.001和0.003。病例組腫瘤位于賁門211 例(41.9%)，非賁門293 例(58.1%);組織學(xué)分型:彌漫型239 例(46.3%)，腸型277 例(53.7%)。

表1 胃癌組和對(duì)照組的基本信息

2.2 hMSH2IVS12-6T＞C多態(tài)性和胃癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性

hMSH2基因IVS12-6T＞C各基因型在對(duì)照組中分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ2=0.34，P=0.558)。分布頻率為:TT，240 例(40.6%);TC，279 例(47.1%);CC，73(12.3%)例。在胃癌組中的分布頻率為:TT，230例(41.7%);TC，258例(46.7%);CC，64 例(11.6%)。以野生基因型 TT為參照，攜帶突變T等位基因的基因型TC和CC在病例和對(duì)照組中頻率分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.882和0.569);合并突變基因型(TC+CC)與野生型TT相比與胃癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)無(wú)明顯關(guān)聯(lián)(調(diào)整 OR=0.96，95%CI=0.75 ～ 1.23，P=0.756)。結(jié)果見(jiàn)表 2。

表2 hMSH2IVS12-6T＞C基因型和胃癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性

2.3 hMSH2IVS12-6T＞C多態(tài)性和胃癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的分層分析

我們對(duì)年齡、性別、吸煙、飲酒等因素進(jìn)行分層分析，發(fā)現(xiàn)hMSH2IVS12-6T＞C合并突變基因型與年輕人群(年齡≤63歲)胃癌和年老人群胃癌(年齡 ＞63歲)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)無(wú)顯著關(guān)聯(lián)性(調(diào)整OR=0.99，95%CI=0.70 ～ 1.30 和調(diào)整 OR=0.93，95%CI=0.64 ～1.33)，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)與性別、吸煙、飲酒等因素亦無(wú)顯著關(guān)聯(lián)性。結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

DNA錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair，MMR)通路廣泛存在于生物體中，是進(jìn)化保守的生化通路，首先在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)，主要功能是修復(fù)DNA復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生的錯(cuò)配，維護(hù)基因組完整性和穩(wěn)定性［6］。人類MMR通路由 7 個(gè)基因組成:MSH2、MSH6、MSH3、MLH1、PMS2、PMS1 和 MLH3［7-8］。其中 hMSH2 基因是第一個(gè)被分離到的人類錯(cuò)配修復(fù)基因，于1993年Fishel等克隆。該基因與細(xì)菌MutS同源，位于人類染色體2p21-22，其基因組全長(zhǎng)約73Kb(不包括啟動(dòng)子)，含16個(gè)外顯子，其中第7個(gè)外顯子最長(zhǎng)，有279bp，而第11個(gè)外顯子最短為98bp，cDNA全長(zhǎng)3 111bp，含2 727bp的開(kāi)放閱讀框架，編碼蛋白含934個(gè)氨基酸殘基［9］。hMSH2通過(guò)與hMSH6或hMSH3蛋白結(jié)合形成異源二聚體，可以識(shí)別并結(jié)合到錯(cuò)配的DNA序列，從而在錯(cuò)配修復(fù)中發(fā)揮作用。

hMSH2IVS12-6T＞C多態(tài)與許多腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，Palicio等［10］對(duì)西班牙人群進(jìn)行病例-對(duì)照研究，發(fā)現(xiàn)IVS12-6CC等位基因可使結(jié)直腸癌的發(fā)生危險(xiǎn)性增高(調(diào)整 OR=2.48，95%CI=1.08～5.66)。但也有相反報(bào)道，Raptis等［11］報(bào)道該位點(diǎn)的多態(tài)性與加拿大人群結(jié)直腸癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)聯(lián)性。在韓國(guó)人群，Jung等［3］的研究表明攜帶IVS12-6CC基因型的個(gè)體與IVS12-6TT基因型個(gè)體相比，發(fā)生肺癌的危險(xiǎn)性增高(調(diào)整OR=1.52，95%CI=1.02 ～2.27，P=0.01)。Hishida 等［4］對(duì) 103 例日本非霍奇金淋巴瘤患者和487例對(duì)照者的研究中發(fā)現(xiàn)，IVS12-6CC基因型可增加非霍奇金淋巴瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(調(diào)整 OR=1.44，95%CI=0.94 ～2.23)，但不具有顯著性差異。

表3 hMSH2IVS12-6T＞C基因型和胃癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的分層分析

我們采用TaqMan MGB探針，針對(duì)IVS12-6T＞C位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。反應(yīng)體系包括一對(duì)引物及2個(gè)分別檢測(cè)不同等位基因的MGB探針，根據(jù)不同的等位基因?qū)?yīng)不同的熒光，探針的5'端標(biāo)記FAM(檢測(cè)T等位基因)或HEX(檢測(cè)C等位基因)，3'端標(biāo)記不發(fā)光的淬滅基團(tuán)并連接一個(gè)MGB基團(tuán)。連接MGB基團(tuán)的探針可與互補(bǔ)的DNA形成高度穩(wěn)定的雙螺旋，大大增加配對(duì)與非配對(duì)模板間的Tm值差異，Johnson等［12］報(bào)道該方法錯(cuò)誤率＜1%。

本研究系病例-對(duì)照研究，對(duì)一些可能的混雜因素進(jìn)行了調(diào)整，因此研究結(jié)果比較可信。但我們的研究結(jié)果未發(fā)現(xiàn)hMSH2基因IVS12-6T＞C多態(tài)性位點(diǎn)與胃癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有顯著關(guān)聯(lián)性，分層分析也未發(fā)現(xiàn)他們與研究人群的年齡、性別、吸煙、飲酒等因素有顯著關(guān)聯(lián)性，從表2中可以看出，CC基因型可降低胃癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(OR＜1)，但不具有顯著性差異(P＞0.05)，原因可能與種族差異或樣本含量較少有關(guān)。

總之，本研究通過(guò)TaqMan MGB探針基因分型技術(shù)，對(duì)hMSH2 IVS12-6T＞C多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，未發(fā)現(xiàn)hMSH2 IVS12-6T＞C多態(tài)變異與中國(guó)江蘇宜興人群胃癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)存在顯著關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果需在今后的大樣本研究或其他功能學(xué)研究中進(jìn)一步加以驗(yàn)證。

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