薛承銳,周曉磊

實(shí)驗(yàn)研究

慢性胰腺炎糖代謝特征及柴胡疏肝散的干預(yù)作用

薛承銳,周曉磊

目的：觀察慢性胰腺炎大鼠糖代謝變化以及中藥柴胡疏肝散對(duì)其的干預(yù)作用。方法：Wistar大鼠制備慢性胰腺炎模型，隨機(jī)分為模型組、對(duì)照組、中藥低劑量組和高劑量組，進(jìn)行糖耐量和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)，RT-PCR法和Western blot法檢測(cè)肝臟胰島素受體mRNA水平和蛋白表達(dá)變化。結(jié)果：模型組大鼠存在糖耐量異常和胰島素抵抗，肝臟胰島素受體表達(dá)較對(duì)照組顯著降低（P＜0.05），兩中藥組的表達(dá)較模型組顯著上調(diào)（P＜0.05）。結(jié)論：慢性胰腺炎引起糖代謝障礙，柴胡疏肝散可能是通過(guò)上調(diào)肝臟胰島素受體表達(dá)的機(jī)制，改善胰島素抵抗，進(jìn)而發(fā)揮治療糖代謝障礙的作用。

慢性胰腺炎；糖代謝；胰島素受體；柴胡疏肝散

慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)是由于各種原因造成的胰腺實(shí)質(zhì)局部、節(jié)段性或彌漫性慢性進(jìn)展性炎癥[1]，可導(dǎo)致胰腺內(nèi)、外分泌功能障礙。內(nèi)分泌功能障礙臨床上表現(xiàn)為不同程度的糖代謝障礙，包括糖耐量異常和高血糖等。文獻(xiàn)報(bào)道，約1/3的CP患者繼發(fā)糖尿病，70%以上的患者存在糖耐量異常[2]。因此，深入研究CP糖代謝特征及其發(fā)生機(jī)制，探索新型治療藥物對(duì)于改善患者的預(yù)后，具有重要的科學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雌性Wistar大鼠40只，體重180～250 g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證編號(hào)SCXK津2005-0001)， 12 h日光燈照射維持晝夜循環(huán)。

1.2 主要試劑 99%油酸購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；柴胡疏肝散（柴胡6 g、陳皮6 g、川芎4.5 g、香附4.5 g、枳殼4.5 g、芍藥4.5 g、炙甘草1.5 g）由天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院制劑室煎制成濃度0.56 g/mL的水煎劑；胰島素受體(insulin receptor,IR)和β-actin兔抗大鼠單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，PCR擴(kuò)增引物由南京金斯特公司合成。

1.3 分組與干預(yù) 大鼠隨機(jī)分為模型組、對(duì)照組、中藥低劑量組和高劑量組，每組10只。模型組和兩中藥組大鼠采用油酸胰膽管注射的方法建模；對(duì)照組僅打開(kāi)腹腔輕度翻轉(zhuǎn)胰腺后關(guān)腹。6周后中藥低劑量和高劑量組大鼠，分別每日每只予柴胡疏肝散水煎劑1.4 g/kg、2.8 g/kg體重灌胃，模型組與對(duì)照組大鼠予等量蒸餾水灌胃，共4周。整個(gè)實(shí)驗(yàn)持續(xù)10周。

1.4 口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn) 口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)（oral glucose tolerance test,OGTT）：給藥后4周，大鼠禁食16 h，按2 g/kg劑量將預(yù)先配制好的1.11 mmol/L無(wú)菌葡萄糖溶液灌胃，尾靜脈取血，微量血糖儀測(cè)定各組大鼠0、30、60、120、180 min血糖值。

1.5 胰島素耐量實(shí)驗(yàn) 胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(insulin tolerance test,ITT)：給藥后4周，各組大鼠按0.75 UI/kg的人胰島素注射，于注射后0、30、60、120 min尾靜脈取血微量血糖儀測(cè)定血糖。

1.6 RT-PCR檢測(cè)肝臟IR mRNA水平 OGTT和ITT實(shí)驗(yàn)后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，開(kāi)腹迅速摘取肝臟組織，即刻液氮冷凍2 h，-76℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。TRIzol提取肝臟總RNA，取2 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄，25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物序列如下：IR上游引物5’-AGG ACT GGC GCT GTG TAA A-3’及下游引物5’-CTG AGT GAT CGT GAG GTT GTG-3’，擴(kuò)增片斷524 bp；β-actin上游引物5’-GTTGACATCCGTAAAGACC-3’及下游引物5’-TCATCGTACTCCTGCTTG-3’，擴(kuò)增片斷233 bp。反應(yīng)條件為：94℃變性5 min后，進(jìn)入94℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸45 s的熱循環(huán)，循環(huán)35次后，終末延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，以目的片段與內(nèi)參擴(kuò)增片段條帶的吸光度積分值的比值來(lái)評(píng)定IR mRNA的表達(dá)水平。

1.7 Western blot檢測(cè)肝臟IR蛋白表達(dá) 取100 mg凍存組織，加入裂解液冰浴中勻漿，低溫離心去除DNA和細(xì)胞碎片，BAC法測(cè)定蛋白總量。按每樣品槽20 μg蛋白上樣，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，封閉抗原后加入一抗（1∶200）4℃過(guò)夜，次日洗膜后進(jìn)行二抗雜交（1∶2 000），DAB法顯色。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶的吸光度積分值的比值來(lái)評(píng)定IR蛋白的表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料均以表示，多個(gè)樣本均數(shù)間比較用單因素方差分析(one way ANOVA)，均數(shù)間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。以P＜0.05為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 OGTT實(shí)驗(yàn) 藥物干預(yù)4周后，OGTT結(jié)果顯示，空腹?fàn)顟B(tài)下(0 min)血糖：模型組血糖較對(duì)照組顯著升高（P＜0.05），高劑量組與模型組比較顯著降低（P＜0.05），而低劑量組與模型組比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。30 min和60 min血糖：模型組較對(duì)照組顯著升高（P＜0.05），兩中藥組與模型組比較均顯著降低（P＜0.05），兩組之間比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；120 min血糖：模型組仍顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），低劑量組較模型組血糖有一定程度降低（P＞0.05），高劑量組與模型組比較顯著降低（P＜0.05）；180 min血糖：模型組仍顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），兩中藥組均顯著低于模型組（P＜0.05）。各時(shí)點(diǎn)血糖值見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血糖OGTT結(jié)果(mmol/Ln=10)

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血糖OGTT結(jié)果(mmol/Ln=10)

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；高劑量組與低劑量組比較，△P＜0.05

組別對(duì)照組模型組低劑量組高劑量組180 min 4.10±0.68#6.78±0.37*5.23±1.31*#4.43±0.77#0 min 4.02±0.43#5.75±0.19*5.65±1.03*4.78±0.64#30 min 6.73±1.54#8.98±1.74*7.52±0.68#7.33±0.71#60 min 6.37±1.01#9.17±1.72*7.37±0.41#7.08±0.37#120 min 5.27±0.38#7.32±1.09*6.63±0.90*5.40±1.24#△

2.2 ITT實(shí)驗(yàn) 注射胰島素后0 min血糖：各組之間比較均無(wú)顯著性差異；30 min和60 min血糖：對(duì)照組較模型組顯著降低（P＜0.05），兩中藥組的血糖也顯著低于模型組（P＜0.05），而兩組之間比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；120 min血糖：對(duì)照組仍低于模型組（P＜0.05），高劑量組也顯著低于模型組（P＜0.05），而低劑量與模型組比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。各時(shí)點(diǎn)血糖值見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血糖ITT結(jié)果(mmol/L，,n=10)

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血糖ITT結(jié)果(mmol/L，,n=10)

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別對(duì)照組模型組低劑量組高劑量組120 min 4.05±1.54#5.52±1.46*5.13±1.19 4.02±1.09#0 min 4.78±1.36 5.32±1.79 5.93±0.26 5.35±0.26 30 min 3.23±0.43#4.53±1.57*3.43±0.63#3.20±0.45#60 min 2.73±0.68#4.20±1.55*2.63±0.44#2.53±0.75#

2.3 肝臟IR mRNA水平 模型組IR mRNA水平顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，兩中藥組與模型組比較均顯著上調(diào)(P＜0.05)，而且高劑量組mRNA水平顯著高于低劑量組(P＜0.05)。

2.4 肝臟IR蛋白表達(dá) 模型組IR蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，兩中藥組與模型組比較均顯著增高(P＜0.05)，而且高劑量組蛋白表達(dá)更接近于對(duì)照組，二者比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

隨著我國(guó)人民生活水平提高和飲食結(jié)構(gòu)改變，CP的發(fā)病率逐年增加，對(duì)CP引起糖代謝障礙的研究越來(lái)越重要，如何平穩(wěn)安全地控制這類患者的血糖仍然是一項(xiàng)世界性難題。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為，CP的病因多為長(zhǎng)期嗜酒、飲食不節(jié)、情志不暢，致使肝膽脾胃功能失調(diào)，而表現(xiàn)為肝郁氣滯，脾胃濕熱蘊(yùn)結(jié)為主的實(shí)熱或濕熱郁結(jié)。胰腺炎癥反復(fù)發(fā)作，久之肝胃郁熱，火炎于上，津液泄于下；肝之疏泄太過(guò)，腎之閉藏失司，則糖尿病“三多一少”癥狀隨之而起。本實(shí)驗(yàn)中，OGTT結(jié)果顯示模型組各時(shí)點(diǎn)血糖值較對(duì)照組均顯著升高，表明CP模型大鼠的糖耐量異常，即糖代謝發(fā)生障礙；同時(shí)ITT結(jié)果顯示注射胰島素前，模型組與對(duì)照組比較血糖值并沒(méi)有顯著性差異，而注射后30 min、60 min和120 min 3個(gè)時(shí)點(diǎn)的血糖值均顯著高于對(duì)照組，提示CP模型大鼠存在胰島素抵抗，可能是導(dǎo)致糖代謝障礙的一個(gè)重要因素。

柴胡疏肝散源于明·張介賓《景岳全書(shū)》，是在《傷寒論》四逆湯的基礎(chǔ)上去枳實(shí)加枳殼、陳皮、川芎、香附而成，具有疏肝解郁、理氣止痛功效，臨床常用于治療肝氣郁結(jié)證。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用柴胡疏肝散水煎劑治療4周后，OGTT實(shí)驗(yàn)顯示兩中藥組大鼠的糖耐量較模型組有不同程度的改善，高劑量組各時(shí)點(diǎn)的血糖值均顯著低于模型組，而低劑量組30 min、60 min和180 min的血糖值也顯著低于模型組；ITT結(jié)果亦顯示兩中藥組的胰島素抵抗較模型組有不同程度的改善，高劑量組30 min、60 min和120 min的血糖值顯著低于模型組，而低劑量組30 min和60 min的血糖值顯著低于模型組，這些結(jié)果表明柴胡疏肝散治療CP糖代謝障礙療效確切，能夠明顯改善糖耐量異常和胰島素抵抗，而且效果呈一定劑量依賴性。

近年來(lái)的研究表明，機(jī)體在CP病理狀態(tài)下，存在明顯的肝臟胰島素抵抗，即胰島素抑制肝臟葡萄糖輸出(hepatic glucose production,HGP)的能力下降，引起血糖升高[3-4]。參與胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的有IR、IR后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及作用的效應(yīng)蛋白，任何一部分出現(xiàn)異常均可導(dǎo)致胰島素抵抗[5-8]。IR為一種跨膜蛋白，有2個(gè)α亞基和2個(gè)β亞基構(gòu)成，廣泛存在于肝臟等對(duì)胰島素作用敏感的組織細(xì)胞膜上。胰島素與IR的α亞基結(jié)合后，啟動(dòng)β亞基酪氨酸蛋白激酶活性，引起β亞基自身酪氨酸磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致胰島素受體底物磷酸化，發(fā)揮胰島素的生物學(xué)效應(yīng)。IR數(shù)目和親和力的改變都可以引起胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常。因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)CP模型大鼠的肝臟IR表達(dá)進(jìn)行了研究，RT-PCR結(jié)果顯示模型組肝臟IR的mRNA水平較對(duì)照組顯著降低，而Western blot也得到了一致的結(jié)果，這些表明IR表達(dá)的降低可能是CP引起肝臟胰島素抵抗，進(jìn)而導(dǎo)致糖代謝障礙的機(jī)制之一。另外，兩中藥組的肝臟IR mRNA水平和蛋白表達(dá)較模型組有不同程度的上調(diào)，表明柴胡疏肝散可能是通過(guò)上調(diào)肝臟IR表達(dá)的機(jī)制，治療CP糖代謝障礙的。

CP大鼠的糖代謝發(fā)生障礙，表現(xiàn)為糖耐量異常和胰島素抵抗，應(yīng)用柴胡疏肝散治療4周后，CP大鼠的上述異常均得到了改善，上調(diào)肝臟IR表達(dá)可能是其治療機(jī)制之一，本研究為探索新型的針對(duì)CP患者的降糖藥物提供了新思路，對(duì)于改善CP患者的預(yù)后具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

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（收稿：2009-10-08）

（責(zé)任編輯 瞿 全 崔乃強(qiáng)）

Glycometabolism in Chronic Pancreatitis and Intervening Effect of Chaihu Shugan San（柴胡疏肝散）

Xue Chengrui,Zhou Xiaolei. Department of Surgery Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, General Hospital of Tianijin Medical University,Tianjin(300052),China

Objective To observe the glycometabolism in chronic pancreatitis rats,and the intervention of chaihu shugan san(柴胡疏肝散)on the changes. Methods Chronic pancreatitis rat model was established by injection of oleic acid into the pancreatic duct,and 40 rats were divided into model group,chaihushugansan high dose group,and low dose group randomly,moreover with a control group.Glucose tolerance test and insulin tolerance test were carried out.The level of hepatic IR mRNA was determined by reverse transcription poly?merase chain reaction.Expression of hepatic IR was observed by Western blot. Results Compared with the control group,glucose and insulin tolerance of model group was abnormal,the hepatic IR in mRNA level and expression was decreased significantly.While compared with the model group,the expression of IR medication groups was up-regulated significantly. Conclusion Chronic pancreatitis caused glycometabolism dysfunction. Chaihushugansan can up-regulate the expression of IR,attenuating the insulin resistance,resulting in the im?provement of glycometabolism in chronic pancreatitis.

chronic pancreatitis,glycometabolism,insulin receptor,chaihushugansan

R675.5+1

A

1007-6948(2010)02-0189-03

天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合外科（天津300052）