徐 娜,劉 明,李寶玉,柳紀(jì)省

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所傳染病室,家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州730046)

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸性人獸共患傳染病,其臨診癥狀多為口腔黏膜、蹄部和乳房皮膚發(fā)生水皰。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須上報(bào)的動物傳染病,我國將其列為一類動物傳染病。該病宿主范圍廣,傳播途徑多,傳播速度快,曾在世界范圍內(nèi)多次暴發(fā)流行,給各國造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。僅2007年-2009三年間,世界各國就多次暴發(fā)口蹄疫,并造成了不小的損失[1]。因此,如何更好地控制或消滅FMD已成為各國獸醫(yī)工作者的主要任務(wù)之一。近年來RNAi現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為生命科學(xué)領(lǐng)域開辟了新天地。隨著研究方法的逐步完善,科研工作者已經(jīng)把RNA i應(yīng)用到生物學(xué)研究的各個(gè)方面,RNAi技術(shù)同樣也應(yīng)用于口蹄疫病毒的相關(guān)研究中,這為FMD的防控帶來新希望。本文就RNA i在宿主細(xì)胞內(nèi)抑制FMDV復(fù)制的研究進(jìn)展做一綜述。

1 FMDV引起宿主細(xì)胞病變機(jī)制

FMDV侵染細(xì)胞,先決條件是吸附宿主細(xì)胞,而這種吸附過程依賴于宿主細(xì)胞受體。FMDV顆粒表面的宿主識別位點(diǎn)與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合,病毒粒子經(jīng)過胞飲作用或吞噬作用而進(jìn)入細(xì)胞胞質(zhì)中,然后將其核酸釋放到靶細(xì)胞相應(yīng)部位,在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行RNA復(fù)制、翻譯和病毒裝配。宿主細(xì)胞中溶酶體的酸性環(huán)境使病毒粒子周圍的酶類降解,并誘導(dǎo)衣殼蛋白發(fā)生構(gòu)想變化,衣殼蛋白膨脹,病毒基因組RNA經(jīng)吞噬小泡膜上的孔道釋放出來。FMDV與其他小RNA病毒成員相似,FMDV感染宿主細(xì)胞約6 h后,新形成的感染性病毒粒子開始出現(xiàn),包裝好的有侵染力的病毒顆粒在細(xì)胞中大量增殖造成細(xì)胞損傷、裂解、死亡,病毒粒子從而被釋放到胞外,之后開始感染新的宿主細(xì)胞。

病毒感染宿主細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞病變甚至死亡的機(jī)制主要有兩個(gè),一方面病毒產(chǎn)生的特異蛋白直接作用于細(xì)胞。病毒基因組RNA進(jìn)入胞質(zhì)后,隨即以其自身基因組作為m RNA,利用宿主細(xì)胞翻譯系統(tǒng)開始病毒蛋白的合成。隨著病毒蛋白翻譯合成,宿主細(xì)胞的帽依賴性m RNA的翻譯受到抑制。小RNA病毒對宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的抑制可能是病毒引起翻譯起始因子失活,以及病毒RNA同宿主mRNA競爭有限的核糖體的結(jié)果[2]。另一方面是病毒感染機(jī)體后,刺激機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞免疫間接誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。其機(jī)制是病毒感染細(xì)胞后通過關(guān)閉或干擾宿主細(xì)胞正常合成代謝誘發(fā)細(xì)胞凋亡,或由病毒編碼的蛋白因子直接作用于細(xì)胞與凋亡有關(guān)的因子及蛋白水解酶而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。例如3C蛋白酶以及L蛋白酶可引起細(xì)胞凋亡。這兩個(gè)蛋白具有蛋白酶活性,分別屬于不同的蛋白家族,都能水解宿主細(xì)胞的翻譯起始因子eIF-4A或eIF-4G,阻斷宿主細(xì)胞的蛋白合成過程,結(jié)果導(dǎo)致宿主細(xì)胞的凋亡。當(dāng)哺乳動物細(xì)胞感染FMDV后,翻譯起始子eIF4A在胞內(nèi)被分裂。LiW等[3]研究表明,感染FMDV的哺乳動物細(xì)胞的翻譯起始因子eIF4A被3C蛋白酶在E143和V 144之間水解成N端和C端兩個(gè)游離片段,使eIF4A失去活性。但3C蛋白酶不能裂解eIF4AII。當(dāng)eIF4AI被修飾后,在分裂位點(diǎn)附近可產(chǎn)生與eIF4A II相同的序列,可以阻斷蛋白質(zhì)水解作用。Belsham G J等[4]研究發(fā)現(xiàn)在FMDV感染的細(xì)胞中,病毒基因編碼的3C蛋白酶的積累與宿主細(xì)胞翻譯起始子eIF4A和eIF4G的切割緊密相關(guān)。Hinton T M等[5]研究發(fā)現(xiàn),FMDV的L蛋白酶在感染中是重要的決定簇,它擁有兩種不同的催化水解的活性位點(diǎn)。L蛋白酶在L/VP4結(jié)合位點(diǎn)處的C末端突出水解活性,誘導(dǎo)分裂翻譯起始子eIF4G;它的另一獨(dú)特的特點(diǎn)是具有刺激腸道病毒內(nèi)核糖體結(jié)合位點(diǎn)的活性。其結(jié)果抑制了宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成,最終導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡。

研究發(fā)現(xiàn),小RNA病毒科的2B和2C非結(jié)構(gòu)蛋白已被證實(shí)與細(xì)胞病變有關(guān)。當(dāng)FMDV感染宿主細(xì)胞后,能阻斷宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)分泌途徑,這是由于FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白2BC阻斷了參與蛋白運(yùn)輸?shù)膬?nèi)質(zhì)網(wǎng)(endop lasm ic reticu lum,ER)高爾基體途徑。通過試驗(yàn),研究機(jī)體分泌途徑時(shí)發(fā)現(xiàn),只有在2BC共同作用時(shí)才能阻斷宿主細(xì)胞的分泌途徑,而2B和2C單獨(dú)存在時(shí),不能阻斷宿主細(xì)胞的分泌途徑。因此,FMDV阻斷蛋白質(zhì)分泌依賴于2B和2C,2C決定阻斷位點(diǎn)的位置[6]。M ercedes G B等[7]利用免疫熒光技術(shù)檢測了感染FMDV的BHK細(xì)胞質(zhì)中的2B和2C分布情況,發(fā)現(xiàn)他們散落在細(xì)胞質(zhì)中,這樣可有效阻止宿主蛋白分泌,引起宿主細(xì)胞病變甚至死亡。

2 RNA干擾的機(jī)制

RNAi是一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程,它通過一個(gè)短雙鏈RNA(dsRNA)分子引起具有相同序列的m RNA發(fā)生降解來關(guān)閉相應(yīng)的基因表達(dá)活性的過程[8-9],已經(jīng)作為一項(xiàng)新興的基因沉默工具在抗病毒研究領(lǐng)域體現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢。參與RNA i作用的分子主要有siRNA s、尋標(biāo)酶(A rgonaute)、切丁酶(Dicer)、切段酶(Slicer)、RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing com plex,RISC)[10]。

siRNA是真核細(xì)胞中的dsRNA經(jīng)Dicer切割降解形成分子質(zhì)量大小為21 bp～25 bp的dsRNA分子,siRNA兩端有2個(gè)單核苷酸延伸,是RISC確定作用目標(biāo)和m RNA結(jié)合的序列。A rgonaute是位于RISC的中心部位的一種重要蛋白家族,分子質(zhì)量約100 kb,與RNA i反應(yīng)有關(guān),簡稱AGO酶。A rgonaute具有2個(gè)結(jié)構(gòu)域,分別為PAZ和RIW I。PAZ位于AGO酶的中心部位,能與siRNA 3′端結(jié)合;RIW I位于AGO酶的C端,能與m RNA分子結(jié)合,它是M g2+依賴的Rnase H的結(jié)構(gòu)同系物,它可以在靶RNA易斷裂的磷酸基團(tuán)處進(jìn)行切割[11]。Dicer酶屬于核糖核酸內(nèi)切酶(RNaseⅢ),具有解旋酶活性,含dsRNA結(jié)合區(qū)以及PAZ結(jié)構(gòu)區(qū),它在細(xì)胞中將dsRNA加工裂解為siRNA s[12]。Slicer是RISC中的主要組成部分,主要是把目標(biāo)m RNA靶序列切成兩段。RISC含Dicer-2蛋白(Dcr-2),R2D2蛋白,A rgonaute蛋白。RISC的作用是對靶mRNA進(jìn)行識別和切割,在RNA及蛋白質(zhì)因子Argonaute的作用下,誘導(dǎo)靶m RNA的特異性降解。Dcr-2蛋白指導(dǎo)siRNA的一條鏈進(jìn)入RISC復(fù)合體,R2D2具有dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,與Dcr-2都是RISC中siRNA解鏈必需的[13]。

dsRNA介導(dǎo)的同源性靶m RNA降解過程主要分為兩步[14]。第一步(起始階段)為較長dsRNA在ATP參與下被Dicer切割加工成21 bp～25 bp的由正義鏈和反義鏈組成的siRNAs。siRNAs的兩條單鏈末端為5′磷酸和3′羥基,且3′端均有2個(gè)～3個(gè)突出的核苷酸。第二步(效應(yīng)階段)是位于RISC復(fù)合物中心部位的AGO蛋白,通過AGO蛋白的PAZ結(jié)合域,與ds-siRNA結(jié)合,在結(jié)合siRNA之后,RISC復(fù)合物進(jìn)入激活的狀態(tài),利用A TP提供的能量在RNA解旋酶參與下ds-siRNA被解旋成單鏈?；罨腞ISC復(fù)合物在單鏈siRNA引導(dǎo)下識別mRNA中的靶序列,引導(dǎo)Slicer在m RNA分子中與單鏈siRNA結(jié)合的部位切割靶m RNA分子。被降解的m RNA片段和未降解的完整mRNA均可作為引物,在RdRP作用下合成更多dsRNA,新合成的dsRNA進(jìn)入下一輪的RNAi循環(huán),從而對RNAi效應(yīng)起放大作用。

3 RNAi抑制FMDV在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制

FMD滅活疫苗一般是在接種7 d后才能產(chǎn)生保護(hù)性抗體,而FMDV的復(fù)制和傳播速度相當(dāng)快,動物感染FMDV 2 d后,病毒復(fù)制達(dá)到高峰,便可出現(xiàn)典型的臨床癥狀。因此,在這方面,目前傳統(tǒng)的滅活疫苗不能完全同步地保護(hù)受威脅動物免受FMDV的侵犯。但是,RNA i技術(shù)能迅速且有效的保護(hù)動物抵抗FMDV的感染,并增強(qiáng)機(jī)體抗病毒能力,可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)抗病毒策略的不足,有利于控制FMD的暴發(fā)。

3.1 RNA i抑制FMDV復(fù)制策略

FMDV的宿主識別位點(diǎn)主要由VP1的三肽序列A rg-Gly-Asp(RGD)組成。RGD序列是多種細(xì)胞外蛋白與細(xì)胞表面整聯(lián)蛋白受體作用的通用識別位點(diǎn),介導(dǎo)病毒對細(xì)胞的感染。RNAi已作為一種有效的抗病毒方法,它通過沉默哺乳動物細(xì)胞中基因表達(dá)而起到抗病毒作用。Lv K等[15]根據(jù)T7RNA聚合酶設(shè)計(jì)并合成與FMDV VP1基因相應(yīng)的siRNA s。試驗(yàn)證明,5個(gè)siRNAs與質(zhì)粒pVP1-EGFPN形成VP1-EGFP融合蛋白和siRNA共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞,對病毒顯示出巨大的序列特異性的沉默效應(yīng)。并且,利用RT-qPCR、病毒滴度和活力分析表明,當(dāng)FMDV感染BHK-21細(xì)胞時(shí),VP1-siRNA 517、VP1-siRNA 113和VP1-siRNA 519在FMDV復(fù)制中充當(dāng)短暫的蛋白抑制劑。據(jù)了解,FMDV多位點(diǎn)區(qū)域的變異揭示出FMDV基因序列高突變率,而且基因組中單核苷酸置換可以被鑒別出,這種突變可以抵抗RNA i。由于FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因是變異率最高的區(qū)段,而siRNA對基因的抑制又存在高度特異性,所以,FMDV的保守區(qū)段是比較理想的靶序列。因此,RNAi技術(shù)的應(yīng)用主要著手于FMDV保守區(qū)域的研究。

3.2 RNA i抑制FMDV增殖最新研究進(jìn)展

Delos Santos T等[16]利用質(zhì)粒表達(dá)短小發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(short hairpin RNA,shRNA),直接作用于編碼FMDV的保守區(qū)2B非結(jié)構(gòu)蛋白的RNA。當(dāng)病毒感染細(xì)胞后,這些細(xì)胞能顯著地抑制FMDV RNA和蛋白質(zhì)的合成,并且細(xì)胞內(nèi)病毒數(shù)量明顯少于對照組。該研究證明針對RNA病毒保守區(qū)設(shè)計(jì)合成siRNA抑制病毒的復(fù)制是可行的。從試驗(yàn)結(jié)果可知,RNA i可能成為預(yù)防或緊急治療FMDV感染的可行方法。Joyappa D H等[17]利用shRNA作用于FMDV的2個(gè)區(qū)域3D和5′-UTR(它們是病毒復(fù)制中必不可少的組成部分)構(gòu)建h7K RNA聚合酶Ⅲ啟動子,研究shRNA在BHK-21細(xì)胞和豚鼠體內(nèi)抗FMDV復(fù)制的能力。試驗(yàn)結(jié)果顯示,用102TCID50 FMDV攻擊轉(zhuǎn)染3DshRNA的細(xì)胞時(shí),能降低病毒在細(xì)胞中的生長速度。100μg shRNA表達(dá)質(zhì)粒通過頸部皮下注射豚鼠,80%豚鼠能抵抗102TCID50 FMDV的攻擊(豚鼠是第一個(gè)被報(bào)道的用于FMD疫苗保護(hù)試驗(yàn)的模式生物)。這一研究表明,shRNA是一種有效控制FMDV感染和擴(kuò)散的方法。另外,韓曉榮等[18]新近首次根據(jù)口蹄疫基因疫苗的已有研究基礎(chǔ)和存在的問題,利用反義核酸能夠抑制病毒復(fù)制的特點(diǎn),在逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體的不同多克隆位點(diǎn)時(shí)分別插入了一段反義核酸免疫基因,使反義核酸在免疫空白期能夠抑制FMDV的復(fù)制。Pengyan W等[19]利用計(jì)算機(jī)程序中的生物信息學(xué)的知識對FMDV基因組序列進(jìn)行同源性分析,可知3D和2B1是2個(gè)特效的siRNA靶位區(qū),利用FMDV的7個(gè)血清型構(gòu)建2個(gè)siRNAb表達(dá)載體pSi-FMD2和pSi-FM。siRNA表達(dá)載體用來檢測siRNAs在BHK-21細(xì)胞和乳鼠上抑制病毒復(fù)制的能力。試驗(yàn)結(jié)果證明轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)的質(zhì)粒的BHK-21細(xì)胞,能顯著的降低細(xì)胞病變的發(fā)生。并且,轉(zhuǎn)染shRNA表達(dá)質(zhì)粒的BHK-21細(xì)胞,能抵抗FMDV A型,O型和Asia I,這種抗病毒效應(yīng)能持續(xù)存在48 h。通過檢測轉(zhuǎn)染抗FMDV的siRNA s細(xì)胞的病毒滴度,半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(50%tissue culture in fective dose,TCID50),可知病毒滴度、TCID50均低于對照組。而且,通過頸部皮下注射siRNA表達(dá)質(zhì)粒載體,乳鼠感染O型和A sia I型FMDV的機(jī)會顯著降低。

Chen W等[20]采用人重組腺病毒為載體表達(dá)siRNA,并評估了其在IBRS-2細(xì)胞、豚鼠及家豬中對FMDV的抑制效應(yīng),結(jié)果表明,腺病毒能夠完全抑制FMDV在細(xì)胞水平的復(fù)制;在豚鼠試驗(yàn)中,腺病毒的抑制效應(yīng)亦十分顯著,但無論如何改變試驗(yàn)條件動物均無法獲得100%保護(hù),在FMDV易感動物家豬中,頸部肌肉注射腺病毒能夠明顯減輕FMD癥狀,降低血清中FMDV的抗體水平,這是世界上第一個(gè)有關(guān)RNA i在FMDV易感動物水平有效性的評估工作。在體外試驗(yàn)中,RNA i能夠有效的抑制病毒的復(fù)制,Chen W等[21]進(jìn)一步利用復(fù)制缺陷型的人腺病毒5型(adenovirus type5,Ad5)為載體表達(dá)shRNAs,shRNAs能夠直接抵抗FMDV結(jié)構(gòu)蛋白1D(Ad5-NT21)或聚合酶3D(Ad5-POL),當(dāng)豬IBRS-2細(xì)胞接種shRNAs后可以完全抵抗同源FMDV的感染,但僅僅Ad5-POL能夠抑制同源FMDV的復(fù)制。體內(nèi)產(chǎn)生的sh RNAs能顯著降低易感動物(如豚鼠和豬)感染FMDV的敏感性。用106PFU Ad5-POL接種豚鼠,24 h后用同源FMDV攻擊,有60%的豚鼠能夠抵抗半數(shù)感染量(50%infectious doses ID50)的病毒。豬接種含有2×109p fu的A d5-NT21-Ad5-POL混合物,24 h后用同源病毒100ID50對豬進(jìn)行攻毒,60%豬能抵抗FMDV的攻擊,但高劑量的腺病毒混合物并不能增強(qiáng)動物的保護(hù)性。試驗(yàn)證明,在動物體內(nèi)RNAi技術(shù)能抵抗FMDV。金紅等[22]通過對國內(nèi)流行FMDV毒株的序列分析,鎖定RNA干擾的3個(gè)目標(biāo)基因即3D,VP4和2B,分別編碼聚合酶POL,病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP4和非結(jié)構(gòu)蛋白2B,這3個(gè)靶基因序列在不同流行毒株之間相對保守。分別設(shè)計(jì)合成靶向這些基因序列的shRNA表達(dá)模板,構(gòu)建了5個(gè)shRNA表達(dá)質(zhì)粒p3D-NT56、p3D-NT19、pVP4-NT65、pVP4-NT19和2B-NT25。進(jìn)行單獨(dú)應(yīng)用或混合應(yīng)用,于細(xì)胞水平和乳鼠水平檢測其抗病毒活性。結(jié)果顯示,3DNT56/19、VP4-NT65/19和2B-NT25shRNA對O型FMDV均有抑制作用,但是對AsiaⅠ型FMDV,僅2BNT25shRNA具有較顯著的抑制作用。3個(gè)shRNA表達(dá)質(zhì)粒(p3D-NT56+pVP4-NT65+p2B-NT25,p3DNT19+pVP4-NT19+p2B-NT25)的混合使用,不僅能夠交叉抑制不同血清型FMDV的復(fù)制,而且這種抑制作用較單一shRNA延續(xù)更長的時(shí)間。

由此可見,RNAi技術(shù)在防控FMD方面,將具有獨(dú)特作用,這也為最終消滅FMD帶來希望。

4 展望

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的不斷發(fā)展,RNAi技術(shù)作為一項(xiàng)新興的基因沉默工具越來越引起人們的關(guān)注,此項(xiàng)技術(shù)覆蓋生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。RNAi能抑制病毒的復(fù)制,引起細(xì)胞凋亡,目前已在抗病毒、抗腫瘤、鑒定基因功能、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等研究領(lǐng)域體現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢,備受廣大科研工作者青睞。

在未來的FMDV研究中,應(yīng)針對病毒基因序列的保守區(qū),設(shè)計(jì)帶有標(biāo)記的RNAi基因片段,同時(shí)解決合成的RNAi基因片段能在宿主細(xì)胞內(nèi)持續(xù)存在問題,將有助于研究宿主細(xì)胞阻斷病毒復(fù)制機(jī)制和某些未知基因的功能,并為研制新型抗病毒藥物奠定基礎(chǔ)。

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