張啟鳴

（大連大學 生物工程學院,遼寧 大連 116622）

基因工程在提高植物抗逆性上的研究進展

張啟鳴＊

（大連大學 生物工程學院,遼寧 大連 116622）

篩選具有抗性的目的基因,通過不同方式轉(zhuǎn)入到受體細胞,并使其在受體細胞中表達,以提高植物的抗逆性。利用基因工程提高植物抗逆性具有廣闊發(fā)展前景。

基因工程;植物;抗逆性

在自然環(huán)境中,植物的生長發(fā)育往往受到干旱、高溫、低溫、鹽漬、重金屬、氧化等逆境脅迫。利用基因工程可以把抗逆目的基因經(jīng)體外切割、拼接與重組后,引人到受體細胞,使其在受體內(nèi)進行復制、表達,按人們預先設(shè)計的要求改變受體細胞的遺傳特性,然后由轉(zhuǎn)化細胞再分化出有預期新性狀的工程植株,這些新植株就具有較高的抗性。

一、目的基因的篩選與修飾

伴隨著分子生物學和植物細胞及組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展,人們能夠從生化及分子水平上認識植物對逆境脅迫的抗性機理,并且從其遺傳物質(zhì)中篩選出與抗性機理有關(guān)的基因,并對它們進行修飾,這就是目的基因。

植物的耐鹽、耐溫機理是多方面的。鹽地堿蓬是一種具有很強抗逆性的真鹽生植物,目前從鹽地堿蓬已克隆出、可作為抗鹽關(guān)鍵基因而進行基因工程操作的目的基因主要四種:合成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的關(guān)鍵酶基因、調(diào)控抗氧化防御反應(yīng)的抗氧化基因、離子平衡的調(diào)節(jié)基因和鹽脅迫信號轉(zhuǎn)導的相關(guān)基因[1]?！鳌?二氫吡咯 -5-羧酸合成酶基因（SsP5CS）和肌醇-1-磷酸合成酶基因（SsIPNS）,兩種基因已從鹽地堿蓬成功克隆出來,它們分別是脯氨酸合成及肌醇合成的關(guān)鍵酶基因,在鹽脅迫下,兩者在轉(zhuǎn)錄水平均有升高,由此推斷它們可能與抗鹽特性有一定關(guān)系。[2-3]M PA激酶是重要的鹽脅迫信號轉(zhuǎn)導通路之一[4],目前已從鹽地堿蓬分離出M PA激酶基因,該基因讀碼框長1572bp,編碼一個含524個氨基酸的蛋白質(zhì),在低溫、干旱和高鹽脅迫下,其轉(zhuǎn)錄水平均有升高。[1]一般認為,Na+離子是造成鹽害的主要離子,已從鹽地堿蓬克隆出液泡膜Na+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白基因（SsNHX1）,它在鹽誘導下顯示高表達。[5]但也有報道認為,滲透脅迫下K+營養(yǎng)不足是造成植物對鹽敏感的關(guān)鍵因素。[6-7]

甜菜堿是高等植物在逆境條件下重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),但某些植物由于體內(nèi)缺少合成甜菜堿的相關(guān)酶,如甜菜堿醛脫氫酶（BADH）、膽堿氧化酶（COD）等,而無法合成甜菜堿。[8]應(yīng)用植物基因工程技術(shù),將外源甜菜堿基因?qū)敕翘鸩藟A積累種或使其過量表達,是提高植物抗逆能力,培育抗逆新品種的一條有效途徑。[9]目前,已經(jīng)從菠菜、甜菜、山菠菜、大麥、高粱等多種植物中克隆了甜菜堿醛脫氫酶（BADH）基因。[10-14]Deshnium等[15]成功地從節(jié)桿菌中克隆了編碼膽堿氧化酶（COD）的基因codA,并將其導入藍藻,提高了對鹽害和低溫的抗性。Rathinasabathi等[16]成功地將煙草中的膽堿單加氧酶（CMO）基因分離,并導入水稻中。CMO是合成乙酰-甜菜堿的第一步反應(yīng)酶基因,攜帶這種基因的植物有很強的抗旱性。

另外,從冰葉日中花的cDNA文庫中分離的肌醇-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因（Imtl）已經(jīng)得到克隆[17],可在鹽堿或干旱脅迫下誘導表達,其轉(zhuǎn)基因植物對鹽害和干旱具有一定的抗性[18]。Hightower（1991）[19]成功地將比目魚體內(nèi)的抗凍蛋白（A FP）基因轉(zhuǎn)入番茄,可以在番茄體內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄AFP的mRNA,這種轉(zhuǎn)基因番茄的組織提取液在冰凍條件下能有效地阻止冰晶的增長,轉(zhuǎn)基因植株的抗凍能力明顯提高。

目前,已經(jīng)分離得到的目的基因有 100多個[20],可分為六大類:種子貯存蛋白基因、與光合作用有關(guān)的基因、與抗逆性有關(guān)的基因、與生長分化有關(guān)的基因、生長素合成基因以及其他的如蔗糖合成酶、乙醇脫氫酶、玉米的轉(zhuǎn)座子、一些植物的線粒體、葉綠體基因等。

目的基因獲得以后,往往需要經(jīng)過經(jīng)體外切割、拼接與重組等修飾后才能利用,引人到受體細胞。為了使目的基因在受體細胞中很好地表達,必須選擇適當?shù)膯幼?首先要切去原基因的啟動子和內(nèi)含子,然后選用適當?shù)膯幼舆B接到該目的基因上。王關(guān)林等[21]成功從枯草芽孢桿菌中克隆果糖聚合酶基因sacB,并將CaMV 35s啟動子連接到該基因上,通過農(nóng)桿菌將其導入番茄,獲得了轉(zhuǎn)sacB基因的番茄,通過抗凍試驗表明,sacB基因在番茄中很好的表達,賦予轉(zhuǎn)基因番茄良好的抗寒性狀。國外研究人員已分離克隆出3個與水稻耐淹能力有關(guān)的基因pdcl、pdcll和pdclll,并采用不同的啟動子轉(zhuǎn)入水稻基因組中,獲得部分轉(zhuǎn)基因植株。[16]張玉秀等成功克隆干旱誘導啟動子和重金屬誘導啟動子,這些啟動子的使用可以大大降低能量消耗,使轉(zhuǎn)基因植物在獲得抗逆性的同時,又不影響正常的生長發(fā)育。[22]

二、外源基因?qū)胫参?/h2>

將外源基因?qū)胫参锸荏w的方法有多種,從受體角度來看,可歸納為二類:一類是將外源基因?qū)胫参锏脑|(zhì)體或植物的細胞、組織,這種方法受植株再生的限制;另一類是將外源基因直接導入植物體。

1.將外源基因?qū)朐|(zhì)體或植物的細胞、組織的方法主要有以下幾種

葉盤法:將植物的葉片、子葉、表皮薄壁細胞或其它組織進行人為損傷（如切割）,造成傷口后,放入農(nóng)桿菌溶液中浸泡一段時間（一般為幾分鐘）,利用農(nóng)桿菌介導。把這些浸染過的組織放在適當?shù)呐囵B(yǎng)基上培養(yǎng),可以再生出轉(zhuǎn)基因植株,這種方法對雙子葉植物的適用性較高。以獼猴桃的葉片、下胚軸、莖段為受體,利用農(nóng)桿菌介導,將 GUS（葡糖苷酸酶）和NPTⅠ（新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶）等外源基因?qū)氆J猴桃獲得轉(zhuǎn)基因植株。[23]

聚乙二醇法（PEG）:這種方法常以植物的原生質(zhì)體作為外源目的基因的受體,將受體細胞的原生質(zhì)體懸浮在含有目的基因的介質(zhì)中,由于PEG的處理,促進了原生質(zhì)體攝取目的基因,從而實現(xiàn)受體細胞的轉(zhuǎn)化?？的蜖柎髮W的研究人員應(yīng)用PEG介導技術(shù)成功將 GUS基因?qū)胨驹|(zhì)體,并得到轉(zhuǎn)化植株。[24]

微注射法:采用微注射法可以將目的基因直接注入受體細胞的原生質(zhì)體或細胞核、線粒體中,微注射法每次可注射少量受體細胞,但轉(zhuǎn)化率很高。這種方法已經(jīng)在煙草、油菜等原生質(zhì)體上獲得成功。[25]

電穿孔法:在高電壓的外加電場中（一般為1～1.25KV/OM-1處理10毫秒）,植物的原生質(zhì)體膜上產(chǎn)生可恢復的瞬間通道,外源基因可以通過通道進入原生質(zhì)體,從而實現(xiàn)細胞轉(zhuǎn)化。用這種方法轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體已經(jīng)再生出可孕的轉(zhuǎn)基因玉米和水稻等植株[26]。

超聲波法:利用強脈沖超聲波的作用,將目的基因?qū)胧荏w細胞,使其復制表達。上世紀90年代,中國農(nóng)科院利用此方法成功將目的基因?qū)霟煵輀27,28]。

粒子轟擊法:將外源DNA包埋在金屬微粒中或附于金屬微粒表面,在高電壓下將金屬微粒加速并噴射,使其穿透細胞壁打入受體細胞,這樣外源基因即可進入受體細胞,這種方法的轉(zhuǎn)化率較高。美國Christou研究小組應(yīng)用此方法成功將 GUS基因?qū)胨静@得轉(zhuǎn)化植株[24]。

2.外源基因直接導入植物體的方法有以下幾種

花粉管通道法:利用開花植物授粉時形成花粉管的特性,通過花粉管直接導入外源DNA,使植物的卵、合子或早期胚胎細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化,進而實現(xiàn)目的基因的轉(zhuǎn)移。花粉管通道法一般在植物開花幾小時至幾天時間內(nèi)導入外源基因,這可根據(jù)植物的不同以及溫濕度的不同而異?？刹扇∽臃孔⑸?、浸泡、滴注等方式,也可將外源DNA滴注在去掉柱頭的切口處。由于這種方法可以將外源基因直接導入植物體內(nèi),轉(zhuǎn)化率高,還不受植株再生的限制,是目前較多采用的方法,而且已經(jīng)獲得棉花、小麥、水稻、番茄、花生、大豆等二十多種轉(zhuǎn)基因植株。[20]

粒子轟擊法:這種方法不僅可以應(yīng)用于外源基因?qū)朐|(zhì)體、細胞或組織中,也可用于外源基因直接導入植物體。應(yīng)用粒子轟擊法,可以將水稻的根、葉、雄蕊、胚等器官作為外源基因的受體,由于這些器官或組織容易由體胚發(fā)生途徑再生植株,可省去原生質(zhì)體再生這一困難環(huán)節(jié)。[24]

浸泡法:可以將植物的胚、種子、幼苗等浸泡在含有外源基因的溶液中,這些受體在吸水的同時而將外源DNA帶入。一般浸泡時間在2～3天。這種方法操作簡單,易于推廣。陳啟鋒等采用浸泡法成功將牛胰DNA導入大麥、玉米、大豆等作物[29]。

注射法:采用注射法同樣可以將外源基因?qū)胫参矬w。王全偉、徐香玲等用注射法將DREB1C基因（652bp）轉(zhuǎn)入大豆獲得成功,該基因的編碼產(chǎn)物可有效調(diào)控植物的耐旱、耐鹽等逆境。[30]在水稻孕穗期開花前幾天,在其穗頸處下部注射DNA溶液50微升,從而將外源基因?qū)胫参矬w。[31]

三、轉(zhuǎn)基因細胞的鑒定

為檢測外源基因是否已經(jīng)進入細胞并獲得表達,必須對轉(zhuǎn)基因細胞進行鑒定。目前主要采用報告基因檢測法。

報告基因檢測法是現(xiàn)在常用的鑒定方法,報告基因是檢測外源基因?qū)胫参锛毎笫欠窬哂泄δ艿囊环N指示基因,通過檢測報告基因的表達,可以了解與其相連的外源基因的表達。目前常用的報告基因如下:

氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（CA T）,它可使氯霉素轉(zhuǎn)化成3-乙酰氯霉素和1,3-二乙酰氯霉素,從而使氯霉素失活,因此凡是進入植物細胞并抗氯霉素的,既說明外源轉(zhuǎn)基因已經(jīng)表達。

新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（NPT）,它可以使轉(zhuǎn)化細胞對某些抗生素如慶大霉素、卡那霉素產(chǎn)生抗性,從而使抗生素失活,以此鑒定外源基因在受體中的表達。樊軍鋒利用葉盤法和基因槍相結(jié)合的方法,用雙價耐鹽基因—1-磷酸甘露醇脫氫酶基因/6-磷酸山梨醇脫氫酶基因—轉(zhuǎn)化秦美獼猴桃,經(jīng)誘導不定芽及誘導生根階段卡那霉素連續(xù)篩選,獲得了卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化植株。[32]

熒光素酶基因,這種基因可以合成熒光素酶,該酶在氧化熒光素的過程中發(fā)出熒光,可以用熒光器檢測到,從而鑒定外源基因的表達。

四、基因工程在提高植物抗逆性的展望

利用基因工程將外源抗逆基因?qū)胫参锛毎蛑参矬w,從而提高其抗逆性,具有廣闊的發(fā)展前景。我國是轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品研究開發(fā)的大國,目前轉(zhuǎn)基因植物的種植量位居全球第四。[33]但通過基因工程提高植物抗逆性的研究仍有許多問題亟待解決。植物的抗逆性往往不是由單個基因決定的,而是由多基因控制的數(shù)量性狀[34],因而對提高植物的抗逆性,尤其對一些屬數(shù)量性狀的,僅僅靠一個外源基因的導入來提高植物抗逆性有一定難度,利用基因組工程轉(zhuǎn)入一系列基因,可綜合提高植物的抗逆性,具有廣闊前景。[35]更多地篩選具有抗逆性狀的目的基因、提高外源基因的轉(zhuǎn)化率、轉(zhuǎn)基因細胞的植株再生、有效解決基因沉默現(xiàn)象、轉(zhuǎn)化植株后代的遺傳穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)基因植物的安全等問題,都是基因工程研究所必須解決的。

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Progress in Research of Genetic Engineering Improving Plant Stress Resistance

ZHANG Qi-ming

（College of Biological Engineering,Dalian University,Dalian 116622,China）

Select the target gene which owns stress resistance,transplant into the receptor cells in different ways,make it express itself,thus the plant stress resistance is improved.It is promising to improve plant stress resistance by using genetic engineering.

genetic engineering;plant;stress resistance

Q947

A

1008-388X（2010）01-0057-04

2010-01-10

張啟鳴（1987-）,女,山東煙臺人。

閱文]