李淑云，羅頌平

(廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510000)

補腎法對腎虛排卵抑制模型大鼠妊娠的內(nèi)分泌激素、臟器濕重及妊娠率的影響

李淑云，羅頌平△

(廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510000)

目的:探討補腎法對腎虛排卵抑制模型大鼠妊娠的內(nèi)分泌激素、臟器濕重及妊娠率的影響。方法:采用羥基脲灌胃造腎虛排卵抑制大鼠模型，造模成功后予以羅氏促排卵湯和/或針灸補腎法治療，治療后的第6天與雄鼠合籠，合籠后繼續(xù)治療10d取出雄鼠，1周后觀察大鼠內(nèi)分泌激素、臟器濕重及妊娠率的情況。結(jié)果:治療后各治療組大鼠內(nèi)分泌激素及臟器濕重及妊娠率均有不同程度的增加。結(jié)論:補腎法包括補腎復(fù)方和/或針刺加電針對腎虛-排卵抑制病理模型大鼠進行治療，可以有效增加大鼠的妊娠率，但對大鼠其他臟器濕重、內(nèi)分泌指標的影響無統(tǒng)計學(xué)意義。

補腎法;腎虛排卵抑制模型大鼠;內(nèi)分泌激素、臟器濕重及妊娠率

本研究以SD大鼠腎虛排卵抑制模型為研究工具，以羅氏促排卵湯和/或針灸補腎法為施加因素，研究補腎法對腎虛排卵抑制模型的促排卵作用。通過觀察與雄鼠合籠各組大鼠的血清性激素、子宮和卵巢等臟器的濕重、妊娠率，探討補腎法對排卵障礙性模型大鼠的妊娠影響，為臨床治療提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

10～12周齡、體重220g～250g左右的 SPF級SD大鼠，來源于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。

1.2 藥物、試劑

1.2.1 羥基脲 魯衛(wèi)藥準字(2000)第024014號，片劑0.5/片，山東齊魯興華制藥廠生產(chǎn)，批號20010407。

1.2.2 羅氏促排卵湯方的水提濃縮液 羅氏促排卵湯方組方:菟絲子20g，制巴戟15g，淫羊藿10g，當(dāng)歸 10g，黨參 20g，炙甘草 6g，熟附子 6g(先煎)，熟地15g，枸杞子20g，加工制作后每毫升含生藥量為1.55g/ml。

1.2.3 試劑 E2、P、HCG放免試劑盒，由北京科美東雅生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 分組

隨機將SPF級成熟雌性SD大鼠分為 A組(腎虛排卵抑制模型組)、B組(造模加中藥組)、C組(造模加針刺組)、D組(造模加針刺加中藥組)、E組(正常對照組)5組。

1.4 方法

1.4.1 造模方法 成熟雌性大鼠根據(jù)陰道細胞圖片確定，并在卵泡早期給予羥基脲灌胃，用生理鹽水配制，300mg/kg/d，灌胃第 19天加大藥量為500mg/kg/d，固定飼料統(tǒng)一喂養(yǎng)，自由飲水，隔日晨陰道涂片。

1.4.2 造模成功標準 隔日進行陰道脫落細胞涂片檢查，持續(xù)僅觀察到核上皮或局化上皮，無周期性變化者;病理改變提示為排卵抑制;觀察大鼠的表現(xiàn):出現(xiàn)拱背，蜷縮少動、反應(yīng)較為遲鈍、體毛疏松不光亮、肌肉松弛、進食量減少等腎虛表現(xiàn)，符合腎虛-排卵抑制的證候與病理特征，則造模成功。

1.5 藥物和/或針灸干預(yù)

根據(jù)分組情況分別給予干預(yù)。中藥:大鼠藥物的用量根據(jù)大鼠體重換算公式計算而得。公式:公斤體重劑量(mg/kg)dB=dA×RB/RA×(WA/WB)1/3(R代表比重系數(shù)，B代表大鼠，A代表人)。針灸取穴:取雙側(cè)子宮穴、雙腎俞穴、中極穴、關(guān)元穴，根據(jù)不同部位的穴位進針后接電針儀，選用波形、疏密波;電量 15Hz，大小 0.5，加電 10min，將大鼠放入大鼠固定器中，10min后取針。

1.6 采血與取材

藥物和/或針灸干預(yù)的第6天，將各組大鼠與雄鼠合籠，合籠后繼續(xù)治療10d后取出雄鼠，各組大鼠繼續(xù)自然喂養(yǎng)7d處死，眼眶后靜脈取血，保留血清待測激素水平。取血后在無菌條件下處死、解剖，剪取垂體、腎、腎上腺、脾、卵巢、子宮，剔除脂肪，各臟器分別用電子分析天平稱濕重。妊娠大鼠記錄妊娠胚胎數(shù)和胚胎直徑。

1.7 觀測指標

一般情況如形態(tài)、毛色、活動、納食、大便等。解剖后肉眼觀察垂體、腎、腎上腺、脾、卵巢、子宮，電子分析天平稱濕重。測定血清促卵泡成熟激素雌二醇(estradiol，E2)、孕酮(Progesterone，P)、β 絨毛膜促性腺激素(β-human chorionic gonadotropin，β-HCG)定量。妊娠大鼠記錄妊娠胚胎數(shù)、胚胎直徑。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計學(xué)分析軟件進行數(shù)據(jù)處理，測定結(jié)果以±s表示，采用單因素方差分析，2組間均數(shù)比較采用t檢驗，以P小于0.05作為統(tǒng)計學(xué)差異的標準。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況

表1 各組大鼠造模前后體重變化(±s，n=12，g)

表1 各組大鼠造模前后體重變化(±s，n=12，g)

注:單因素方差分析，同組造模前后比較:*P<0.05， P<0.01;組間比較:同A組比較:#P<0.05，##P<0.01;同E組比較:△P<0.05，△△P<0.01

組別 造模前體重 造模后體重 造模前后體重差A(yù)組 220.5±13.66 230.8±36.69△△ 10.3±9.54△△ B組 213.3±12.95 240.0±14.12 30.7±6.13 C組 219.2±10.02 251.9±16.32 32.8±4.32 D 組 213.4± 7.44 232.9±27.25△# 19.4±9.70△ E組 217.0± 8.70 263.1±14.89## 46.1±3.30

2.2 觀察體重變化情況

造模成功后進行治療并合籠，觀察治療前后體重變化。

表2 各組大鼠治療前與治療并合籠后體重變化(±s，g)

表2 各組大鼠治療前與治療并合籠后體重變化(±s，g)

注:因素方差分析，同組治療前后比較:*P<0.05， P<0.01;治療前和治療后組間比較:同 E組比較:△P<0.05，△△P<0.01

組別 n 治療前體重 治療后體重 治療前后體重差A(yù)組 4 235.5±19.000△△ 268.2±43.980△△ 32.7±26.862 B 組 4 254.5±15.780 335.5±30.610 81.0±32.270 C組 3 251.3± 8.505 299.3±20.232△ 48.0±10.985 D組 4 230.3±18.892△△ 292.3±26.424△△ 62.0± 8.524 E組 6 272.8±19.763 355.2±18.670 82.3±11.498

2.3 各組大鼠臟器濕重情況

2.4 各組大鼠 E2、P、β-HCG

表3 各組大鼠臟器濕重(±s，g)

表3 各組大鼠臟器濕重(±s，g)

注:單因素方差分析，治療后組間比較:同 A組比較:#P<0.05，##P<0.01;同 E組比較:△P<0.05，△△P<0.01;C與 D比較:▲P<0.05，▲▲P<0.01

組別 n 子宮 卵巢 腎臟 腎上腺 脾臟 腦垂體A組 4 3.116±4.036 0.147±0.042 1.883±0.330 0.068±0.0098 0.863±0.263 0.0097±0.0022 B組 4 6.840±5.700 0.148±0.042 2.084±0.298 0.077±0.0187 0.839±0.127 0.0100±0.0027 C組 3 8.346±3.870#△ 0.159±0.037 2.083±0.122 0.084±0.0171 1.092±0.227 0.0066±0.0089 D組 4 3.516±3.166▲ 0.113±0.018 1.875±0.085 0.078±0.0093 0.849±0.206 0.0080±0.0008 E組 6 6.398±2.440 0.155±0.028 1.981±0.119 0.065±0.0168 0.803±0.098 0.0077±0.0027

表4 各組大鼠E2、P、β-HCG(±s)

表4 各組大鼠E2、P、β-HCG(±s)

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2.5 各組大鼠妊娠情況

表5 各組大鼠妊娠情況(±s)

表5 各組大鼠妊娠情況(±s)

注:因素方差分析，治療后組間比較:同 A組比較:#P<0.05，##P<0.01;同 E組比較:△P<0.05，△△P<0.01

組別 n 受孕例數(shù) 胚胎大小(cm) 胚胎數(shù)(個) 妊娠率(%)A 組 4 2 0.375±0.479 6.25±7.228△50 B組 4 3 0.800±0.606 8.25±5.560 75 C組 3 3 0.900±0.115 10.50±1.528 100 D組 4 3 0.625±0.479 8.25±5.737 75 E組 6 6 0.833±0.151 14.50±2.074#100

3 討論與結(jié)論

3.1 羥基脲造模方法的選擇與使用

羥基脲(Hydroxyurea，簡稱 HU)，又稱羥基脲素，分子式為CH4N2O2，為白色或無色針狀結(jié)晶，無臭，味微澀，微溶于水及醇，固體干燥狀態(tài)較穩(wěn)定，遇水不穩(wěn)定，血漿最高血藥濃度(Tmax)為1h～2h，6h從血中消失，可透過血-腦脊液屏障，20%在肝內(nèi)代謝，80%由尿排出。羥基脲是一種核苷酸還原酶抑制劑，在核苷酸代謝過程中發(fā)揮中心作用，是一種別構(gòu)酶，是惟一受到高度調(diào)控的酶系統(tǒng)。它將二磷酸核苷酸轉(zhuǎn)化為于脫氧核糖核苷酸，參與DNA合成過程中所有前體物的凈合成，該酶活力直接影響DNA合成及腫瘤細胞增殖。

現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)對腎虛的研究認為，下丘腦細胞損害和功能紊亂是腎陽虛證的主要病理基礎(chǔ)，因其損害引起下丘腦-垂體-腎上腺軸、甲狀腺軸、性腺軸不同程度的功能紊亂，同時代謝器官、免疫系統(tǒng)也出現(xiàn)功能和病理的改變，故而腎虛是有物質(zhì)基礎(chǔ)的，是“腎”的功能衰退而引起機體一系列病理變化，包括免疫功能低下、內(nèi)分泌功能紊亂和三大物質(zhì)代謝障礙等［1］。因此，用羥基脲造成的腎虛動物模型，是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下建立的具有人類證候表現(xiàn)的動物實驗對象，該模型已被廣泛認可并使用［2～5］。對于腎陽虛證動物模型造模方法，陳英華等進行了綜述研究，認為腎陽虛動物模型主要有兩大內(nèi)容:一是腎陽虛證病理動物模型，主要有腎上腺皮質(zhì)功能受抑制模型、甲狀腺功能受抑制模型、性腺功能受抑制模型、DNA合成抑制腎陽虛模型等;二是腎陽虛證病因動物模型，主要有恐傷腎腎虛動物模型、老年腎虛動物模型、房勞墮胎傷腎腎虛動物模型、先天腎虛動物模型等［6］。

本實驗選用羥基脲建立成熟雌性大鼠腎虛排卵抑制模型(給予羥基脲300mg/kg/d，連續(xù)18d，第19天開始再給予羥基脲500mg/kg/d，連續(xù)11d)。卵巢病理切片卵泡計數(shù)結(jié)果顯示，造模大鼠卵巢組織中次級生長卵泡與成熟卵泡的比例明顯減少，而以原始卵泡和初級生長卵泡為主，提示造模成功。

3.2 羅氏促排卵湯藥物作用和分析

中醫(yī)學(xué)認為腎主生殖，腎為先天之本，元氣之根，主藏精氣，在機體的整個生命活動中起著主導(dǎo)作用。腎精包括先天之精與后天之精，為生長發(fā)育與生殖之源，故在狹義上又稱為“生殖之精”。腎精是婦女月經(jīng)與胎孕的物質(zhì)基礎(chǔ)。現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)家認為，腎在月經(jīng)產(chǎn)生的機理當(dāng)中，具有相當(dāng)于下丘腦-垂體-卵巢軸中下丘腦一級的調(diào)節(jié)功能，可調(diào)控卵巢的排卵及內(nèi)分泌功能［8、9］。中醫(yī)名家羅元愷教授認為，不排卵者多數(shù)為腎陽虛衰，腎陽虛具有垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)功能低下的表現(xiàn)［7］。羅氏促排卵湯的處方藥物有:菟絲子、制巴戟、淫羊藿、當(dāng)歸、黨參、炙甘草、熟附子、熟地、枸杞子，全方以補腎助陽為主，佐以健脾養(yǎng)血填精，陰陽并重，臨床應(yīng)用于腎陽虛為主的不孕癥患者。

本實驗SD大鼠羥基脲造模成功后，予以補腎法治療干預(yù)，包括羅氏促排卵湯煎劑、針刺加電針、羅氏促排卵湯煎劑+針刺加電針進行治療干預(yù)，治療后與雄鼠合籠，可以使治療各組的大鼠妊娠率增加，子宮、卵巢濕重也有不同程度的增加，特別是針灸組子宮濕重的增加有統(tǒng)計學(xué)意義，說明針灸治療能有效刺激排卵，增加妊娠數(shù)從而增加子宮重量。而腎、腎上腺、脾、腦垂體的變化不明顯，考慮羥基脲腎虛造模對腎、腎上腺、脾、腦垂體的影響不大，故而治療干預(yù)后各組之間也無明顯差異性。模型組大鼠造模成功后，沒有其他干預(yù)措施，本身有自然恢復(fù)傾向，對實驗結(jié)果有一定影響。

3.3 針灸治療不孕癥

針灸療法治療不孕癥，歷史久遠?，F(xiàn)代研究提示，針灸治療不孕癥組要通過以下幾個途徑起作用:①針刺調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢軸的功能，使內(nèi)分泌激素水平改變，生殖內(nèi)分泌功能恢復(fù)正常;②針灸可使患者處于低水平的尿17-羥和尿-17酮含量增高，認為針灸有增強腎上腺皮質(zhì)功能與調(diào)節(jié)性腺軸的作用;③對于輸卵管炎癥及阻塞性不孕癥，針灸治療可改善微循環(huán)及血流變性質(zhì)，從而促進炎癥、壞死組織的吸收和消退，加快組織的修復(fù)和再生，有利于輸卵管的通暢。針灸對體內(nèi)的性激素有雙向調(diào)節(jié)作用，可通過興奮下丘腦-垂體系統(tǒng)而使性腺激素分泌增加，在此過程中可能有某些神經(jīng)遞質(zhì)參與，調(diào)節(jié)促性腺激素釋放激素(GnRH)而影響性腺的分泌。針灸療法對卵巢的影響，可以促進排卵，效果基于一定的雌激素水平，針后出現(xiàn)皮膚溫度升高，即交感神經(jīng)中樞受抑制效果較后。電針可以影響內(nèi)啡肽物質(zhì)和下丘腦-垂體-卵巢軸的功能而排卵。許爽君等觀察針刺配合補腎調(diào)沖中藥對治療功能性無排卵患者的促排卵作用。結(jié)果提示，治療后排卵率達74.8%，基礎(chǔ)體溫連續(xù)測定雙相率明顯提高，卵泡及子宮內(nèi)膜生長發(fā)育比較顯示治療后比治療前顯著增加，血清雌二醇和孕酮水平亦比治療前明顯提高，這就表明針刺配合補腎調(diào)沖中藥有較好的促進血清雌二醇和孕酮正常分泌的作用，能明顯促進卵泡及子宮內(nèi)膜的生長發(fā)育，有強烈的促排卵、健內(nèi)膜作用，可顯著提高排卵和妊娠率［8］。馬瑞芬等對不孕癥患者72例采用針刺療法，觀察其促排卵與血相關(guān)指標的變化，結(jié)果顯示針刺可使脈沖頻率低者加速而促使卵泡生長排卵，促排卵是通過中樞起效，針刺治療后血E2水平也有不同程度的上升［9］。

本實驗所選穴位包括關(guān)元、中極、子宮、腎俞。關(guān)元，中極屬于任脈，均為任脈與足三陰經(jīng)的交會穴，位于臍下，鄰近胞宮，關(guān)元為元陰元陽關(guān)藏之處，能調(diào)和沖任，通于肝脾腎三經(jīng)，燮理元陰元陽，取此二穴位既能健脾導(dǎo)滯，又能疏肝理氣行瘀，還能補益腎陽腎陰，調(diào)和充任氣血。腎俞穴為腎的背俞穴，是腎臟精氣聚集處，取之能補益腎陽，暖功散寒。子宮穴為治療婦科疾病的經(jīng)外奇穴及經(jīng)驗穴，取之能調(diào)經(jīng)種子，理氣止痛。本實驗選用關(guān)元、中極、子宮、腎俞的穴位，均位于腹部及背部，比較容易固定，因大鼠好動依從性差，可以順利完成針刺和電針操作。本實驗結(jié)果也提示，針刺治療何以改善內(nèi)分泌水平，提高妊娠率，模型組大鼠造模成功后，沒有其他干預(yù)措施，本身有自然恢復(fù)傾向，對實驗結(jié)果有一定影響。由于樣本含量不夠大，雖然不同組別大鼠實驗結(jié)果有變化，但有一些在統(tǒng)計學(xué)上差異無顯著性。

4 結(jié)論

通過對SD大鼠羥基脲造模形成腎虛排卵障礙的動物模型進行治療的實驗研究，可以得出以下結(jié)論。

4.1 應(yīng)用羥基脲造?？梢猿晒υ斐赡I虛排卵抑制大鼠動物模型，并以腎虛癥狀為主，兼見脾虛的癥狀。

4.2 補腎法包括補腎復(fù)方和/或針刺加電針對腎虛-排卵抑制病理模型大鼠進行治療，可以有效提高大鼠的妊娠率、妊娠胚胎數(shù)目，不同程度增加子宮及卵巢濕重，但對大鼠其他臟器濕重、內(nèi)分泌指標的影響無統(tǒng)計學(xué)意義。

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△指導(dǎo)老師

R285.5

B

1006-3250(2010)07-0567-03

2009-11-08