倪 青，王 階△，趙安斌，于 斌，王 敏，黃春榮，李恩慶

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053;2.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510632)

生脈散對(duì)2型糖尿病性心肌病大鼠心肌的保護(hù)作用*

倪 青1，王 階1△，趙安斌2，于 斌2，王 敏2，黃春榮2，李恩慶2

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053;2.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510632)

目的:探討生脈散對(duì)糖尿病性心肌病(DCM)大鼠的保護(hù)作用。方法:SD大鼠42只，采用高脂高熱量飲食誘導(dǎo)出胰島素抵抗，加單次中等劑量(50mg/kg)腹腔注射鏈脲佐菌素建立DCM動(dòng)物模型，12周后采用心電圖評(píng)價(jià)心肌受損情況，取血檢測(cè)血糖、膽固醇、甘油三酯，Masson染色檢測(cè)左室心肌膠原含量，Tunel凋亡試劑盒檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡程度，電鏡觀察心肌亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞程度，同時(shí)采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè) TSP-1、TGF-β1、Chymase和TRB-3蛋白的表達(dá)水平，采用Western blotting技術(shù)檢測(cè) TSP-1、A-TGFβ1和 L-TGF-β1蛋白的表達(dá)水平變化。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TSP-1和TRB-3 mRNA表達(dá)水平的變化。結(jié)果:與模型組相比，生脈散組大鼠血糖、膽固醇、甘油三酯明顯降低，心肌組織破壞程度較輕，膠原纖維含量顯著減少，電鏡觀察心肌細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞程度較輕，免疫組化心肌 TSP-1、TGF-β1以及 TRB-3的表達(dá)水平、Western心肌 tsp-1、A-TGFβ1和 L-TGF-β1蛋白表達(dá)水平、PCR、TSP-1 mRNA和TRB-3 mRNA表達(dá)水平降低。結(jié)論:生脈散可通過多條途徑抑制糖尿病心肌病大鼠的心肌纖維化，顯著延緩糖尿病心肌病的發(fā)生進(jìn)程。

生脈散;糖尿病心肌病;凋亡;膠原纖維;TSP-1;TGF-β1;TRB-3;Chymase

糖尿病心肌病(Diabetic Cardiomyopathy，DCM)是指糖尿病患者心肌細(xì)胞原發(fā)性損傷引起廣泛的結(jié)構(gòu)異常，最終引起左心室肥厚、舒張期和(或)收縮期功能障礙的一種疾病狀態(tài)［1］。臨床研究表明，DCM通常以舒張性心力衰竭為早期表現(xiàn)［2］，即心肌松弛性減低和僵硬度增大，心肌間質(zhì)纖維化是舒張性心力衰竭的重要病機(jī)［3］。在組織形態(tài)學(xué)上主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞局灶性肥大、壞死，細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)沉積和心肌纖維化［4］。臨床多中心1278例糖尿病合并冠心病住院病人治療情況發(fā)現(xiàn)，生脈散使用頻率很高。因此，研究生脈散抗心肌纖維化作用，可更好地指導(dǎo)臨床。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

Trizol購自invitrogen生物技術(shù)科技公司，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海貝博生物技術(shù)公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自genecopoeia生物技術(shù)公司，TSP-1、TGF-β1、TRB-3 和 Chymase 單克隆抗體購自美國(guó)santa cruze生物技術(shù)公司，A-TGFβ1和 L-TGF-β1多克隆抗體購自武漢博士德生物技術(shù)公司，ABC檢測(cè)試劑盒購自美國(guó)vectro生物技術(shù)公司，BCA蛋白定量試劑盒購自上海貝博生物試劑公司。鏈尿佐菌素購自Sigma生物技術(shù)公司。生脈散購自暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院。人參9g，麥冬9g，五味子6g，以上藥物麥冬和五味子以10倍量水煎煮1.5h后，人參10倍水另煎1.5h后濾出藥液和其余藥物藥液混合、過濾，濃縮至0.32g/ml。

1.2 動(dòng)物與分組

雄性 SD大鼠42只，體重200g±20g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。隨機(jī)分為3組:正常組(n=12)只，對(duì)照組(n=15)和生脈散組(n=15)。正常組喂以標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料，對(duì)照組及生脈散組喂以高脂高熱量飼料。4周后給予模型組及生脈散組大鼠1次性腹腔注射鏈脲佐菌素50mg/kg，正常組大鼠給予同等劑量檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射;各組以原飼料繼續(xù)喂養(yǎng)1周后，測(cè)定血糖，模型組及生脈散組連續(xù)2次血糖≥16.7 mmol/L且有多飲、多食、多尿的大鼠的納入實(shí)驗(yàn)，共有38只大鼠納入實(shí)驗(yàn)(正常組12只，模型組和丹參飲組各13只)。各組大鼠繼續(xù)以原飼料繼續(xù)喂養(yǎng)9周，14周禁食12h后殺死各組大鼠，心房取血，離心保留血清 －20℃保存以備檢測(cè)血脂、血糖、甘油三酯。采血完畢迅速處死大鼠，取出心臟冰鹽水沖洗，剪除包膜、血管稱重并計(jì)算心臟重量指數(shù)，垂直于心臟左室長(zhǎng)軸對(duì)稱中點(diǎn)上下切取部分心肌，分別放入10%中性甲醛及2.5%戊二醛中固定，其余部分放入-80℃冰箱中保存。共有35只大鼠完成實(shí)驗(yàn)(模型組死亡1只，死亡原因可能為糖尿病并發(fā)癥或感染)。

1.3 心電圖觀察心肌損傷程度

大鼠給予1%戊巴比妥納2ml/kg腹腔注射后做心電圖。

1.4 檢測(cè)血糖甘油三酯總膽固醇的變化

心房取血5ml，4℃，2500r離心保留血清 －20℃保存以備檢測(cè)血脂、血糖、甘油三酯。

1.5 HE染色

10%中性甲醛固定心肌組織標(biāo)本，石蠟切片，行常規(guī)HE染色，光鏡下觀察心肌病理損害并拍照，并結(jié)合超微結(jié)構(gòu)的改變來評(píng)價(jià)心肌的病變。

1.6 透射電鏡觀察

在左心室中部留取小塊組織，以2.5%戊二醛固定10min后細(xì)切(1.0×1.0mm)，再固定12h，1%鋨酸固定1h，乙醇、丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機(jī)制備超薄切片，電子染色，德國(guó)PHILIPSTECNAI-10型透射電子顯微鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)并攝片。

1.7 Masson染色

常規(guī)石蠟切片脫蠟后行Masson染色，光鏡下觀察心肌細(xì)胞呈紅色或黃色，膠原纖維呈藍(lán)綠色，HMIAS彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)定量分析切片每個(gè)視野中CVF(CVF=同一圖像中膠原面積/所測(cè)視野面積)，排除富含膠原的血管和疤痕區(qū)域。每個(gè)切片選取5個(gè)視野，最后取其均數(shù)。

1.8 Tunel細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡

常規(guī)石蠟切片脫蠟后，按試劑盒說明依次滴加試劑，熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長(zhǎng) 450nm～500nm，發(fā)射波長(zhǎng)515nm～565nm。每張玻片選取熒光表達(dá)最強(qiáng)的3～5個(gè)視野觀察并由計(jì)算機(jī)自帶掃描分析軟件測(cè)定熒光強(qiáng)度與面積。指標(biāo)的熒光值=平均熒光強(qiáng)度×平均熒光面積。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

RNA提取與 cDNA的合成:采用 Trizol按試劑盒說明提取RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度和濃度，經(jīng)電泳法檢測(cè)其完整性。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。取2μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行Reamtime PCR檢測(cè)。

引物序列:引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。反應(yīng)體系:2×AllinoneTM Q-PCR MIX 10μl，ddH2O 1μl，F(xiàn)orward Primer(4μM)2μl，Reverse Primer(4μM)2μl，Template cDNA 5μl。Total:20μl。反應(yīng)條件:預(yù)變性:95℃，1min;變性:95℃，15s;退火:60℃，30s;延伸:72℃，30s。共 40個(gè)循環(huán)。

目的基因 引物序列 (5′-3′)產(chǎn)物長(zhǎng)度TRB-3 F:TGTCTTCAGCAACTGTGAGAGGACGAAG R:GTAGGATGGCCGGGAGCTGAGTATC 147bp Tsp-1 F:GGAAGAGCATCACGCTGTTTG R:GCGCTCTCCATCTTGTCACA 73bp β-actin F:GACATCCGTAAAGACCTCTATGCC R:ATAGAGCCACCAATCCACACAGAG 173bp

1.10 免疫組化染色

載玻片采用多聚賴氨酸行防脫片劑處理，常規(guī)石蠟切片脫蠟，0.3% H2O2封閉。置 0.01 mol/L pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液中行微波修復(fù)抗原(中檔火8min～10min，自然冷卻到室溫，反復(fù)3次)。山羊血清封閉，依次加入Ⅰ抗、生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG和辣根過氧化物酶標(biāo)記的卵蛋白-生物素，37℃孵育30 min。以DAB顯色、脫水、透明、封片。陰性對(duì)照用PBS代替Ⅰ抗。

1.11 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)

于超凈工作臺(tái)上，剪取約100mg組織，加入細(xì)胞裂解液 400μl，于冰上研磨，轉(zhuǎn)入 1.5ml離心管中，于冰上裂解 30min后，4℃，12000r離心 10min，取上清液到1.5ml離心管中，此即為蛋白樣品，－80℃冰箱中保存。取上述蛋白樣品40μl，BCA試劑盒蛋白定量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以上蛋白樣品(取20μg)經(jīng)10%聚丙烯凝膠電泳分離后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn))，恒流(GAPDH:240MA，50min;tsp-1:240MA，140min;)將蛋白轉(zhuǎn)移到 PVDF膜(孔徑 0.45μm)上。然后封閉緩沖液(5%脫脂牛奶或BSA)中封閉1h，將膜放入封閉緩沖液稀釋的Ⅰ抗(稀釋比例:GAPDH:1∶100 稀釋，TSP-1:1∶200 稀釋;A-TGF-β1:1∶100;L-TGF-β1:1∶100)中進(jìn)行免疫反應(yīng)，室溫下持續(xù)搖動(dòng)孵育2h，然后4℃過夜。1×PBST洗滌4次，每次5min。將膜用PBST緩沖液稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶6000稀釋)，室溫孵育50min，1×PBST洗滌4次，每次5min。于暗室中滴加新鮮配制的ECL顯色液0.6 mL(A、B液等體積混勻)，膜孵育1 min，封入保鮮膜中，壓片并顯影于感光膠片上。以上步驟獨(dú)立重復(fù)3次。用Bandleader 3.0軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度掃描，按下述公式分別計(jì)算3次實(shí)驗(yàn)中樣品蛋白的相對(duì)含量:蛋白相對(duì)含量(該蛋白條帶的灰度值-背景的灰度值)/(內(nèi)參條帶的灰度值-背景的灰度值)，以此比值計(jì)算均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，組間參數(shù)的比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.13 結(jié)果

(1)大鼠一般生存狀況及生化指標(biāo)變化:糖尿病模型組大鼠在注射STZ后1周內(nèi)出現(xiàn)多飲、多尿、多食癥狀，隨病程的延長(zhǎng)，上述癥狀逐漸加重并出現(xiàn)腹部脹大，嚴(yán)重消瘦，腹瀉，毛發(fā)干燥，色澤黯淡，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)減少，部分大鼠出現(xiàn)呼吸聲粗。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組和生脈散組大鼠血清甘油三酯和總膽固醇水平逐漸升高，各組不同時(shí)點(diǎn)縱向比較差異顯著(模型組和生脈散組的甘油三酯的F值分別為F=25.429和F=7.750，P<0.05;模型組和生脈散組的總膽固醇的 F值分別為 F=9.065和 F=3.54，P<0.05);模型組和生脈散組血糖在不同時(shí)間點(diǎn)逐漸降低，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);正常組不同時(shí)點(diǎn)縱向比較，大鼠血清甘油三酯和總膽固醇水平無顯著差異(P>0.05)。與相同時(shí)間點(diǎn)的正常組比較，模型組和生脈散組大鼠血清甘油三酯和總膽固醇水平明顯升高;與相同時(shí)間點(diǎn)模型組相比，生脈散組大鼠血清甘油三酯和總膽固醇較模型對(duì)照組明顯減低，各組之間兩兩比較，差異顯著(P<0.01);與相同時(shí)間點(diǎn)的正常組比較，模型組和生脈散組大鼠血糖明顯升高;與相同時(shí)間點(diǎn)的模型組相比，生脈散組大鼠空腹水平明顯降低，各組之間兩兩比較，差異顯著(P<0.05)。

(2)心電圖觀察心肌損傷情況:大鼠心電圖顯示ST段抬高明顯，提示心肌已損傷。

(3)病理觀察:HE染色可見正常大鼠心肌細(xì)胞排列整齊、致密，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞外間質(zhì)較少，可見少量成纖維細(xì)胞(圖1A)。模型組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌細(xì)胞肥大、扭曲，細(xì)胞間隙增大，間質(zhì)和血管周圍細(xì)胞外基質(zhì)增多，成纖維細(xì)胞增多，并有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1B)。生脈散組介于兩者之間，與模型對(duì)照組相比，細(xì)胞間隙減小，間質(zhì)和血管周圍細(xì)胞外基質(zhì)減少(圖1C)。

圖1 各組大鼠心肌組織HE染色觀察(200×)

(4)電鏡觀察心肌亞細(xì)胞結(jié)構(gòu):正常大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞間質(zhì)膠原含量很少，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及基底膜結(jié)構(gòu)正常(圖2A)。模型大鼠心肌細(xì)胞肌絲纖維稀疏、扭曲、斷裂，線粒體腫脹，數(shù)量減少，排列紊亂，空泡變性，部分嵴斷裂，糖原減少，間質(zhì)膠原增生，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，毛細(xì)血管基底膜增厚(圖2B)。生脈散組較模型組明顯減輕，間質(zhì)膠原沉積較少，毛細(xì)血管基底膜增厚減輕，介于正常組和對(duì)照組之間(圖2C)。

圖2 各組大鼠心肌組織電鏡觀察(15000×)

(5)Masson染色觀察膠原表達(dá)情況:顯微鏡下觀察，正常組膠原組織分布均勻，相鄰細(xì)胞的膠原纖維網(wǎng)完好，膠原纖維含量少(圖3A);對(duì)照組心肌內(nèi)膠原組織明顯增多，圍繞心肌細(xì)胞的膠原纖維網(wǎng)斷裂、排列紊亂(圖3B);生脈散組心肌膠原組織排列比對(duì)照組稍顯規(guī)整，纖維網(wǎng)結(jié)構(gòu)尚好(圖3C)。

圖3 各組大鼠心肌組織masson染色(100×)

表1 各組大鼠左室組織Masson染色膠原纖維定量分析結(jié)果(±s)

表1 各組大鼠左室組織Masson染色膠原纖維定量分析結(jié)果(±s)

注:△P<0.01

組 別 n 間質(zhì)膠原纖維體積正 常 組12 10.38±2.76模 型 組 11 18.42±3.55△生 脈 散 組 12 15.90±3.00△

采用Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行心肌組織膠原相對(duì)含量測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組相比，糖尿病心肌病變大鼠心肌組織膠原相對(duì)含量明顯增加(P<0.01)，提示該模型大鼠存在膠原纖維增生的病變;與模型組相比，生脈散組膠原含量顯著減少(P<0.05)，提示其可以明顯抑制膠原纖維增生。

(6)Tunel細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡:正常組大鼠的心肌組織僅可見少數(shù)細(xì)胞凋亡(圖4A)，與正常組相比，模型組凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯增多(圖4B)，與模型組相比，生脈散組凋亡細(xì)胞顯著減少(圖 4C)。

圖4 各組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡水平(200×)

(7)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果:與正常組相比，模型組TSP-1和TRB-3的 mRNA表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，生脈散組TSP-1和TRB-3的 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)。

表2 各組大鼠心肌TSP-1和TRB-3 mRNA表達(dá)水平(±s)

表2 各組大鼠心肌TSP-1和TRB-3 mRNA表達(dá)水平(±s)

注:△P<0.01，*P<0.05

組別n TSP-1 TRB-3正 常 組12 0.0091±0.0019 0.0081±0.0030模 型 組 11 0.0144±0.0034* 0.0136±0.0039*生脈散組 12 0.0122±0.0034* 0.0102±0.0023*

(8)免疫組織化學(xué)染色:TSP-1染色陽性信號(hào)為棕色顆粒，定位于心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)。正常組心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見分布均勻、稀疏的淺棕色顆粒(圖5A)，模型組心肌細(xì)胞內(nèi)可見濃密的深棕色顆粒(圖5B)，生脈散丹參飲合劑組心肌細(xì)胞內(nèi)棕褐色顆?？梢娒黠@減少(圖5C)。與正常組相比，模型組心肌TSP-1蛋白表達(dá)量明顯升高;與模型組相比，生脈散組TSP-1表達(dá)量明顯降低，3個(gè)組兩兩相比差異顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖5 各組大鼠心肌組織tsp-1免疫組織化學(xué)染色(200×)

TGF-β1染色陽性信號(hào)為棕色顆粒，定位于心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)。正常組心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見散在、稀疏的淺棕色顆粒(圖6A)，模型組心肌細(xì)胞內(nèi)可見濃密的深棕色顆粒(圖6B)。生脈散組心肌細(xì)胞內(nèi)棕色顆?？梢娒黠@減少(圖6C)。與正常組相比，模型組心肌 TGF-β1蛋白表達(dá)量明顯升高;與模型組相比，生脈散組 TGF-β1表達(dá)量明顯降低，3個(gè)組兩兩相比差異顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

TRB-3染色陽性信號(hào)為棕色顆粒，定位于心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)，正常組心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見散在稀疏的淺棕色顆粒(圖7A)，DCM組心肌細(xì)胞內(nèi)可見濃密的深棕色顆粒(圖7B)。生脈散組心肌細(xì)胞內(nèi)棕色顆?？梢娒黠@減少(圖7C)。與正常組相比，模型組心肌TRB-3蛋白表達(dá)量明顯升高;與模型組相比，生脈散組TRB-3表達(dá)量明顯降低，3個(gè)組兩兩相比差異顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖6 各組大鼠心肌組織TGF-β1免疫組織化學(xué)染色(200×)

圖7 各組大鼠心肌組織TRB-3免疫組織化學(xué)染色(200×)

Chymase染色陽性信號(hào)為棕色顆粒，正常組心肌細(xì)胞間隙和肥大細(xì)胞內(nèi)可見散在稀疏的淺棕色顆粒(圖8A)，DCM組心肌細(xì)胞間隙和肥大細(xì)胞內(nèi)可見較多的深棕色顆粒(圖8B)。生脈散組心肌細(xì)胞間隙和肥大細(xì)胞內(nèi)棕色顆粒可見減少(圖8C)。模型組心肌Chymase蛋白表達(dá)量明顯升高;與模型組相比，生脈散組Chymase表達(dá)量明顯降低，3個(gè)組兩兩相比差異顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖8 各組大鼠心肌組織Chymase免疫組織化學(xué)染色(200×)

(9)Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)情況:心肌組織中TGF-β1是以活性的 A-TGF-β1和非活性的 LTGF-β1形式存在的，與正常組相比，心肌組織中TSP-1、A-TGF-β1、L-TGF-β1 3 種蛋白的表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，生脈散組的 TSP-1、A-TGF-β1、L-TGF-β1 3 種蛋白的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05-0.01)。

表3 各組大鼠心肌 TSP-1、A-TGF-β1和L-TGF-β1蛋白的表達(dá)水平(±s)

表3 各組大鼠心肌 TSP-1、A-TGF-β1和L-TGF-β1蛋白的表達(dá)水平(±s)

注:△P<0.01，*P<0.05

組 別 n TSP-1 A-TGF-β1 L-TGF-β1正 常 組12 93.225±5.371 106.429±6.32 102.461±6.124模 型 組 11 129.772±6.548△ 139.812±7.26△ 144.633±7.377△生脈散組 12 123.307±6.717△ 129.743±6.36△ 129.820±7.555*

2 討論

本研究以高糖高脂高熱量飲食誘導(dǎo)出胰島素抵抗，加小劑量STZ注射建立的動(dòng)物模型，基本符合糖尿病的臨床特點(diǎn)。HE染色病理切片顯示，心肌細(xì)胞肥大、扭曲，細(xì)胞間隙增大，間質(zhì)和血管周圍細(xì)胞外基質(zhì)增多。電鏡觀察顯示，心肌細(xì)胞排列稀疏、斷裂并有大量膠原纖維分布，結(jié)合心電圖示心肌受損，提示本研究成功建立了糖尿病心肌病的動(dòng)物模型。生脈散出自《醫(yī)學(xué)啟源》，方由人參、麥冬、五味子組成，是治療氣陰兩虛證的常用方。近年來常用于急性心肌梗死、冠心病等屬于氣陰兩虛者。研究表明，生脈散還有較好提高脂肪代謝的能力。

糖尿病性心肌病主要以心肌肥大、心肌細(xì)胞大量減少、心肌間質(zhì)及血管周圍纖維化、大量糖原、脂滴沉積及細(xì)胞水平的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷和心肌收縮蛋白的膠原形成等為特征。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊、致密，細(xì)胞間隙較少。masson染色顯示，心肌細(xì)胞間僅有少量膠原纖維，電鏡觀察心肌細(xì)胞排列整齊，線粒體完整，低倍鏡下(1250×)成纖維細(xì)胞數(shù)目較少(≤2個(gè))，而且成纖維細(xì)胞周圍膠原纖維少。與正常組相比，模型組大鼠心肌成纖維細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間隙較多，masson染色顯示心肌細(xì)胞間充滿大量膠原纖維，電鏡觀察心肌細(xì)胞肌絲斷裂崩解，線粒體腫脹、破裂，低倍鏡下(1250×)成纖維細(xì)胞數(shù)目較多(≥5個(gè))，而且成纖維細(xì)胞周圍聚集大量膠原纖維。生脈散組介于兩者之間，與模型組相比，生脈散組大鼠心肌細(xì)胞排列較為整齊，細(xì)胞間隙膠原纖維較少，電鏡低倍鏡下(1250×)成纖維細(xì)胞數(shù)目約為2～4個(gè)，成纖維細(xì)胞周圍有中等量的膠原纖維，提示生脈散可以有效延緩糖尿病大鼠心肌病發(fā)生。

本研究就纖維化過程中的幾個(gè)關(guān)鍵細(xì)胞因子研究，觀察生脈散對(duì)糖尿病心肌病的保護(hù)，為臨床的廣泛應(yīng)用提供證據(jù)。TSP-1對(duì)多種間質(zhì)細(xì)胞的分化、增生具有很強(qiáng)的調(diào)控作用，其異常表達(dá)在多種類型纖維化疾病進(jìn)程中起關(guān)鍵作用［6］。已有研究表明，糖/TSP-1/TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)途徑在糖尿病心肌病心肌間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用［7］。最近1項(xiàng)有關(guān)TRB3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究結(jié)果表明，TRB3對(duì)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的連鎖反應(yīng)具有廣泛和特異的調(diào)控作用，TRB3與MAPKK結(jié)合而調(diào)控MAPK通路信號(hào)蛋白的活性［8］。大量研究證實(shí)，MAPK不僅是糖尿病慢性并發(fā)癥如糖尿病腎病、糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化等的發(fā)生發(fā)展過程的關(guān)鍵細(xì)胞因子［9］，也是心肌纖維化過程中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［10］。糖尿病狀態(tài)下，心肌局部升高的 Ang II，通過多條途徑引起心肌氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、心肌間質(zhì)膠原沉積以及心肌纖維化，在糖尿病心肌病變變的發(fā)生中扮演著重要角色［11］。Chymase除通過生成Ang II引起心肌病變，還可能直接激活TGF-β1從而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、促使心肌纖維化［12］。本研究表明，與正常組相比，模型對(duì)照組masson染色膠原纖維表達(dá)增多，電鏡觀察成纖維細(xì)胞周圍膠原纖維表達(dá)增高，免疫組化結(jié)果表明，與正常組相比，模型組大鼠心肌細(xì)胞 TSP-1、TGF-β1、chymase、TRB-3 表達(dá)量均明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組相比，生脈散組大鼠心肌細(xì)胞 TSP-1、TGF-β1、chymase、TRB-3有不同程度的降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)合masson染色及電鏡結(jié)果，提示生脈散可以有效地緩解糖尿病心肌病的心肌纖維化進(jìn)程，減輕糖尿病心肌病的纖維化程度。Western半定量結(jié)果顯示，與正常組相比，模型對(duì)照組的 TSP-1、ATGF-β1、L-TGF-β1 表達(dá)量均明顯升高。熒光定量PCR結(jié)果顯示，與正常組相比，模型對(duì)照組的TSP-1、TRB-3 mRNA的表達(dá)量增高，說明糖尿病過程中的大鼠心肌組織中纖維化過程中的關(guān)鍵因子在基因和蛋白水平均表達(dá)明顯增高。與模型組相比，生脈散組的 TSP-1、A-TGF-β1、L-TGF-β1 表達(dá)量均明顯降低，提示生脈散可以通過降低纖維化過程中的細(xì)胞因子，從而延緩心肌纖維的發(fā)生。

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△通訊作者:王階，博士后合作導(dǎo)師。E-mail:wangjie@163.com。

Effect of Shengmai San on the on the Rats of Diabetic Cardiomyopathy

NI Qing1，WANG Jie1△，ZHAO An-bin2，YU Bin2，WANG Min2，HUANG Chun-rong2，LI En-qing2
(1.Guang'anmen Hospital China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing100053，China;2.Medical school of Jinan University，Guangzhou510632，China)

Objective:Observe the effect of Shengmai San on the diabetic cardiomyopathy(DCM).Methods:The rat model of DCM was established by eating a high-fat diet together with injection of high dose streptozotocin(50mg/kg)intraperitoneally.After 12 weeks，electrocardiogram was used to evaluate the damage of the myocardial，blood serum GLU，cholesterin and TG were tested by Clinical Chemistry Test Systems.The content of collagen was quantified by Masson staining.Level of cardiomyocyte apoptosis tested by Tunel apoptosis kit.The mRNA level of TSP-1 and TRB-3 was determined by quantification real time RT-PCR，while the protein level of TSP-1、A-TGF-β1 and L-TGF-β1 was analyzed by Western blotting and the protein level of TSP-1、TGF-β1、TRB-3 and Chymase was analyzed by immunohistochemistry.Results:Compared with control group，the rats blood glucose，cholesterol，triglycerides of Shengmai San group were significantly decreased.The Myocardial tissue was less damaged and the collagen content was less than control group.The expression of tsp-1，A-TGF-1 and L-TGF-β1 of the mixed liquor of Shengmai San and Danshen Decoction group in the diabetic cardiac muscle were much less than that in control group.The mRNA level of tsp-1 and TRB-3 were lower than control group by PCR detection.Conclusion:Shengmai San can inhibit the process of fibrosis in diabetic cardiomyopathy myocardial rats muscle and delay the formation of diabetic cardiomyopathy through of hyperglycemia rats through many signal pathways.

Shengmai San;Diabetic cardiomyopathy;Collagen;apoptosis;TSP-1;TGF-β1;TSP-1;TRB-3;Chymase

R285.5

B

1006-3250(2010)07-0572-05

中國(guó)博士后科學(xué)基金一等資助金(20070410129);中國(guó)博士后科學(xué)基金第一批特別資助金(200801166)資助;北京市科委重大項(xiàng)目課題(H020920010330)和科技計(jì)劃課題資助(D08050703020802)

2009-0-0