孫 鑫，許靜靜，陳 偉△

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué) 附屬龍華醫(yī)院ICU，上海 200032;2.安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 醫(yī)療質(zhì)量管理科，安徽 合肥 230031)

芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)壓力超負(fù)荷致慢性心衰大鼠的作用及機(jī)理研究

孫 鑫1，許靜靜2，陳 偉1△

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué) 附屬龍華醫(yī)院ICU，上海 200032;2.安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 醫(yī)療質(zhì)量管理科，安徽 合肥 230031)

目的:探討壓力超負(fù)荷致慢性心衰大鼠的心臟構(gòu)型、心臟功能、細(xì)胞因子的變化及相互關(guān)系。觀察中藥芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)慢性心衰大鼠心室重構(gòu)和心功能的影響及其可能的作用分子機(jī)制。方法:采用腹主動(dòng)脈縮窄法，將70只雄性Wistar大鼠造模，6周后將模型大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、手術(shù)模型組、纈沙坦組、芪藶強(qiáng)心膠囊低、中、高劑量組6組，灌服給藥時(shí)間為6周。治療后用測(cè)定大鼠心臟質(zhì)量、血流動(dòng)力學(xué)、心肌膠原含量的相關(guān)指標(biāo)，同時(shí)應(yīng)用放免法測(cè)定血漿及心肌組織中的血管緊張素Ⅱ的濃度，免疫印跡(Western blot)法檢測(cè)心肌CaN蛋白表達(dá)。結(jié)果:服藥6周后與假手術(shù)組比較，手術(shù)組大鼠心系數(shù)、左室重量指數(shù)、左心室收縮壓和舒張壓、羥輔氨酸含量、AngⅡ濃度和CaN蛋白表達(dá)均明顯增高，差異顯著(P<0.05);與手術(shù)模型組比較，芪藶?zāi)z囊各劑量組心系數(shù)、左室重量指數(shù)、左心室收縮壓和舒張壓、羥輔氨酸含量、AngⅡ濃度和 CaN蛋白表達(dá)均明顯降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異(P<0.05);與纈沙坦組比較，芪藶中、高劑量組各項(xiàng)指標(biāo)差異不顯著(P>0.05)。結(jié)論:芪藶強(qiáng)心膠囊可以減輕心衰大鼠的心室肥厚，抑制心肌纖維化和改善心功能。通過(guò)抑制RAS介導(dǎo)的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)致心肌肥大作用可能是芪藶強(qiáng)心膠囊抑制慢性心衰進(jìn)程的機(jī)制之一。

芪藶強(qiáng)心膠囊;慢性心衰;血管緊張素Ⅱ;CaN信號(hào)通路

近年來(lái)，隨著我國(guó)人口老齡化和高血壓、冠心病發(fā)病率的上升和群體的擴(kuò)大，心力衰竭作為多種心血管系統(tǒng)疾病的終末階段，已成為導(dǎo)致死亡的主要原因之一。各種原發(fā)病導(dǎo)致慢性心力衰竭的共同病理基礎(chǔ)是心室重構(gòu)。心室重構(gòu)包括心肌細(xì)胞的肥大、凋亡和間質(zhì)的纖維化［1］。近期研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)渡激活的RAS系統(tǒng)造成循環(huán)和心肌局部 AngⅡ濃度增加，誘導(dǎo)Ca2+活化的、CaN依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在心室重構(gòu)直至心力衰竭的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用［2、3］。

本研究采用腹主動(dòng)脈縮窄法建立慢性心衰大鼠模型，根據(jù)中醫(yī)理論對(duì)于慢性心衰“心腎陽(yáng)虛為本，血瘀水泛為標(biāo)”的病因病機(jī)認(rèn)識(shí)，應(yīng)用以益氣溫陽(yáng)、活血利水法組方的芪藶強(qiáng)心膠囊干預(yù)實(shí)驗(yàn)性慢性心衰大鼠模型，通過(guò)觀察其對(duì)心衰大鼠心臟結(jié)構(gòu)、心肌膠原含量、心功能、AngⅡ濃度和CaN表達(dá)等方面的影響，探究其干預(yù)心室重構(gòu)及治療心衰的作用及可能的分子機(jī)制。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

70只 9周齡 Wister雄性大鼠，SPF級(jí)，體重210g±10g，用3%戊巴比妥鈉溶液全麻下行腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)，造摸后6周進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)和病理形態(tài)學(xué)觀察，鑒定慢性心衰模型成功與否。

1.2 使用藥品和儀器

纈沙坦膠囊(代文)由北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào) x0371，配制成 80mg/100ml溶液。芪藶強(qiáng)心膠囊干膏粉制劑由河北以嶺制藥公司，生產(chǎn)批號(hào) 20070526，配制成 7.68g干膏粉/100ml、15.36g干膏粉/100ml、30.72g干膏粉/100ml 3種濃度。羥脯氨酸試劑盒、AngⅡ放射免疫分析藥盒、細(xì)胞及組織總蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、埃德多導(dǎo)電生理儀、2021C型紫外分光光度計(jì)、SN-695A智能放免Y測(cè)量?jī)x等。

1.3 治療方法

將模型大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、手術(shù)模型組、纈沙坦組、芪藶強(qiáng)心膠囊低、中、高劑量組6組。第7周開(kāi)始進(jìn)行灌胃，假手術(shù)組和手術(shù)模型組灌服生理鹽水2.5ml/d，纈沙坦組劑量為6.38mg/kg/d，芪藶強(qiáng)心膠囊低劑量為0.64g干膏粉/kg/d，中劑量為:1.28g干膏粉/kg/d，高劑量為2.56g干膏粉/kg/d，以上各治療組均按照每次灌服2.5ml量用雙蒸水配制成藥液，每日1次，灌服6周。

1.4 心臟血流動(dòng)力學(xué)的測(cè)定

用3%戊巴比妥鈉溶液按照30mg/kg劑量腹腔注射麻醉，在右頸總動(dòng)脈做一下斜行切口，插入充滿肝素生理鹽水的PE-50聚乙烯導(dǎo)管，緩緩插入至心室腔，記錄穩(wěn)定波形。利用Powerlab軟件計(jì)算波形得到 HR、LVSP、LVEDP、+/－dp/dtmax等指標(biāo)數(shù)據(jù)。

1.5 心系數(shù)、左室質(zhì)量指數(shù)的測(cè)定

測(cè)完血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)及腹主動(dòng)脈取血后，進(jìn)行分離心臟，稱(chēng)全心重紀(jì)錄，再分離左心室稱(chēng)重記錄，計(jì)算全心重(g)/體重(kg)為心系數(shù)，左心室重(g)/體重(kg)為左室質(zhì)量指數(shù)。

1.6 心肌組織羥脯氨酸含量的測(cè)定

采用比色法測(cè)定。先將心肌組織稱(chēng)重、水解，置于干凈試管中，按照羥脯氨酸試劑盒步驟配制各溶液，依次加樣最后測(cè)定其吸光度，根據(jù)公式:羥脯氨酸(μg/mg濕重)=(測(cè)定管吸光度 －空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度 －空白管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)品(5μg/ml)×水解液總體積(5ml)/組織濕重(mg)，計(jì)算得出心肌的羥脯氨酸含量。

1.7 血漿及心肌組織AngⅡ濃度的測(cè)定

采用核放射免疫測(cè)定法。將大鼠血漿置于室溫中復(fù)融混勻，低溫離心后取上清測(cè)定;而心肌組織經(jīng)過(guò)稱(chēng)重、碾磨水浴、勻漿、低溫離心后，取上清液測(cè)定。根據(jù)試劑盒步驟依次添加試劑溶液，混勻靜置后離心，吸上清液，測(cè)定各管沉淀的放射性計(jì)數(shù)(cpm)。根據(jù)軟件及公式計(jì)算出大鼠血漿和心肌組織中的AngⅡ濃度。

1.8 心肌CaN蛋白表達(dá)量的檢測(cè)

采用免疫印跡(Western blot)法檢測(cè)。先將心肌組織勻漿進(jìn)行蛋白提取定量，超聲波破細(xì)胞，吸取上清液，經(jīng)過(guò) SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜進(jìn)行免疫測(cè)定，X線顯影后拍片看條帶寬度和密度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般情況

假手術(shù)組大鼠反應(yīng)靈敏，活動(dòng)良好，進(jìn)食活躍、體重明顯增長(zhǎng);模型組造摸6周，體重略有上升，而到12周飲食、活動(dòng)明顯減少，肢體頭面部浮腫;各治療組飲食活動(dòng)較假手術(shù)組有減少，體重略有下降，癥狀相對(duì)模型組較輕。

表1 各組大鼠心系數(shù)、心室質(zhì)量指數(shù)的變化(±s，n=8)

表1 各組大鼠心系數(shù)、心室質(zhì)量指數(shù)的變化(±s，n=8)

注:與假手術(shù)組比較:*P<0.05;與手術(shù)模型組比較:△P<0.05;與纈沙坦組比較:□P<0.05

組別心系數(shù) 左室重量指數(shù)假 手 術(shù) 組2.68±0.14 1.83±0.08手 術(shù) 模 型 組 3.48±0.34* 2.36±0.22*纈 沙 坦 組 2.89±0.66 △ 1.92±0.13△中藥低劑量組 3.09±0.27 △ 2.23±0.09 △□中藥中劑量組 2.94±0.15 △ 2.02±0.13 △中藥高劑量組 2.96±0.10 △ 1.99±0.09 △

2.2 大鼠心肌肥厚指標(biāo)

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心系數(shù)、左室重量指數(shù)明顯增大，有顯著差異(P<0.01);與模型組比較，各治療組心系數(shù)、左室重量指數(shù)均有減小，差異明顯(P<0.05);與纈沙坦組比較，中藥各治療組心系數(shù)、左室重量指數(shù)均有增大，但差異不顯著(P<0.05);中藥各治療組組間比較差異不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 大鼠心功能改變

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心率明顯加快，LVSP和+dp/dtmax明顯降低，差異顯著(P<0.05);－dp/dtmax明顯降低，LVEDP顯著升高，差異明顯(P<0.05);與模型組相比，纈沙坦組心率較慢，LVSP和+dp/dtmax升高明顯，LVEDP明顯降低(P<0.05)，中藥各劑量組心率較模型組均較慢，LVSP在中、高劑量組明顯升高，LVEDP高劑量組降低明顯，+dp/dtmax中藥各劑量組均明顯升高，－dp/dtmax高劑量組升高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與纈沙坦組比較，中藥低劑量組心率較快、LVSP較低，差異顯著(P<0.05)，而中、高劑量組則無(wú)差異(P>0.05);中藥各組LVEDP較纈沙坦組均增高(P<0.05);+dp/dtmax中藥低劑量組均明顯降低(P<0.05)，中、高劑量組則無(wú)顯著差異(P>0.05);－dp/dtmax中藥低、中劑量組均降低(P<0.05)，高劑量組有降低，但差異不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠左心收縮功能的比較(±s)

表2 各組大鼠左心收縮功能的比較(±s)

注:與假手術(shù)組比較:*P<0.05;與手術(shù)模型組比較:△P<0.05;與纈沙坦組比較:□P<0.05

組別 n HR(min－1)LVSP(mmHg)+dp/dtmax(mmHg·s －1)假 手 術(shù) 組8 396.87±9.03 168.75±12.10 7368.88±245.69手 術(shù) 模 型 組 7 428.42±8.42* 134.71±5.82* 5795.43±396.75*纈 沙 坦 組 7 408.43±8.36 △ 156.71±6.47 △ 6827.00±263.23 △中藥 低 劑 量 組 6 421.83±8.13 △□141.00±9.63 □ 6238.33±192.63 △□中藥 中 劑 量 組 7 410.00±9.18 △ 146.71±7.59 △ 6532.29±336.61 △中藥 高 劑 量 組 6 403.83±9.09△ 152.33±8.64 △ 6755.67±264.26 △

表3 各組大鼠左心舒張功能的比較(±s)

表3 各組大鼠左心舒張功能的比較(±s)

注:與假手術(shù)組比較:*P<0.05;與手術(shù)模型組比較:△P<0.05;與纈沙坦組比較:□P<0.05

組別 n LVEDP(mmHg)－dp/dtmax(mmHg·s－1)假 手 術(shù) 組8 4.40±0.95 6416.13±273.87手 術(shù) 模 型 組 7 14.91±1.80* 5489.57±293.97*纈 沙 坦 組 7 7.63±1.76 △ 6019.00±173.49 △中藥 低 劑 量 組 6 13.38±2.47 □ 5611.33±362.44 □中藥 中 劑 量 組 7 12.96±2.42 □ 5694.86±169.95 □中藥 高 劑 量 組 6 11.60±1.16 △□ 5935.67±103.54 △

2.4 心肌纖維化指標(biāo)

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌羥脯氨酸含量明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組相比，各治療組大鼠心肌羥脯氨酸含量均有明顯減少，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);中藥中劑量組與纈沙坦組及中藥中、高劑量組比較，大鼠心肌羥脯氨酸含量亦明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義(P<0.05)。

2.5 RAS系統(tǒng)的變化

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血漿AngⅡ濃度明顯升高(P<0.01);與模型組比較，纈沙坦組血漿AngⅡ濃度亦增高(P<0.05);中藥各劑量組較模型組AngⅡ濃度均有下降，而中劑量組下降顯著;與纈沙坦組比較，中藥各劑量組AngⅡ濃度均明顯降低，差異顯著(P<0.05)。

與假手術(shù)組比較，模型組心肌AngⅡ濃度顯著增高(P<0.01);與手術(shù)模型組比較，西藥組心肌AngⅡ含量明顯降低(P<0.05)，中藥各組均有下降，中、高劑量組 AngⅡ含量下降顯著(P<0.05)。說(shuō)明纈沙坦對(duì)局部AngⅡ的分泌有抑制作用，而中藥中、高劑量組也具有明顯降低心肌局部AngⅡ分泌的作用，與纈沙坦組間比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表4 各組大鼠心肌羥脯氨酸含量的比較(±s，n=8)

表4 各組大鼠心肌羥脯氨酸含量的比較(±s，n=8)

注:與假手術(shù)組比較:*P<0.05;與手術(shù)模型組比較:△P<0.05;與纈沙坦組比較:□P<0.05

組別羥脯氨酸含量(μg/mg)假 手 術(shù) 組0.27±0.01手 術(shù) 模 型 組 0.47±0.08*纈 沙 坦 組 0.33±0.03 △中藥低劑量組 0.33±0.03 △中藥中劑量組 0.28±0.03△□中藥高劑量組 0.33±0.07 △

表5 各組大鼠血漿中AngⅡ濃度的比較(±s，n=6)

表5 各組大鼠血漿中AngⅡ濃度的比較(±s，n=6)

注:與假手術(shù)組比較:*P<0.05;與手術(shù)模型組比較:△P<0.05;與纈沙坦組比較:□P<0.05

組別 心肌AngⅡ(pg/g) 血漿AngⅡ(pg/ml)假 手 術(shù) 組587.67±52.27 275.37±40.22手 術(shù) 模 型 組 738.68±37.68* 400.75±40.04*纈 沙 坦 組 653.76±36.04△ 469.35±56.08 △中藥 低 劑 量 組 723.11±21.07 □ 357.16±55.78 □中藥 中 劑 量 組 672.49±28.02 △ 327.83±41.73 △□中藥 高 劑 量 組 668.42±34.57 △ 352.54±63.73 □

2.6 CaN蛋白表達(dá)

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織CaN蛋白表達(dá)量顯著增高，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與手術(shù)模型組相比，纈沙坦組和中藥各劑量組大鼠心肌CaN蛋白表達(dá)量均降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);而與纈沙坦組相比，中藥各劑量組CaN蛋白表達(dá)量均有相對(duì)增高，但差異不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表6 CaN蛋白表達(dá)量(±s，n=6)

表6 CaN蛋白表達(dá)量(±s，n=6)

注:與假手術(shù)組比較:*P<0.05;與手術(shù)模型組比較:△P<0.05;與纈沙坦組比較:□P<0.05

組別CaN 的量假 手 術(shù) 組7.59±1.09手 術(shù) 模 型 組 17.08±2.26*纈 沙 坦 組 9.08±1.73△中藥低劑量組 11.13±2.82 △中藥中劑量組 10.17±1.19 △中藥高劑量組 10.80±1.67 △

3 討論

心力衰竭是多種心血管系統(tǒng)疾病的嚴(yán)重階段，而各種原發(fā)病導(dǎo)致心力衰竭的共同病理基礎(chǔ)便是心室重構(gòu)，主要表現(xiàn)為心肌肥厚、間質(zhì)纖維化、神經(jīng)體液因子的變化及發(fā)生在分子水平的變化。因此，心力衰竭的治療方向是阻斷衰竭的心肌重塑，干預(yù)心肌細(xì)胞內(nèi)的分子生物學(xué)機(jī)制［4］。

研究表明，過(guò)度激活的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS系統(tǒng))是發(fā)生心室重構(gòu)重要的機(jī)制之一，其效應(yīng)物AngⅡ可以引起一系列的后續(xù)效應(yīng)，激活相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)到通路，其中一條“Ca2+/鈣調(diào)素→CaN→NFAT3→心肌細(xì)胞肥大基因表達(dá)→心肌細(xì)胞肥大”的信號(hào)通路，其在心肌肥大直至心衰的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用［5、6］。

中醫(yī)學(xué)對(duì)慢性心衰病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)，是在正氣內(nèi)虛的基礎(chǔ)上，感受外邪，傷及心脾腎陽(yáng)氣，使氣滯血瘀、水氣不化、血瘀水泛、上凌心肺、外溢肌膚所致，即本病為本虛標(biāo)實(shí)之證。本虛為氣虛、陽(yáng)虛，標(biāo)實(shí)為血瘀、水濕、痰飲。而益氣溫陽(yáng)、活血化瘀、瀉肺利水成為治療慢性心衰的主要原則［7、8］。

本實(shí)驗(yàn)研究中，采用以益氣溫陽(yáng)、活血利水法組方的芪藶強(qiáng)心膠囊，發(fā)現(xiàn)它能夠減少心衰大鼠的心系數(shù)和左室質(zhì)量指數(shù)，其中以中、高劑量組作用較明顯(P<0.05);能夠降低心衰大鼠心肌組織中羥脯氨酸的含量(P<0.05)，其中以中劑量組效用較佳;能夠提高慢性心衰大鼠模型LVSP和+/－dp/dtmax的水平，并降低 LVEDP的水平 (P<0.05)，對(duì)大鼠的收縮功能和舒張功能均有一定的影響;可以降低大鼠循環(huán)及心肌組織中 AngⅡ濃度(P<0.05)，提示其治療慢性心衰的作用可能與抑制激活的RAS系統(tǒng)相關(guān);可以降低心肌中CaN的蛋白表達(dá)，提示其對(duì)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)信號(hào)通路具有一定的抑制效應(yīng)。結(jié)果提示，芪藶強(qiáng)心膠囊可以明顯逆轉(zhuǎn)心室肥厚、抑制心肌纖維化和改善心功能;通過(guò)抑制RAS介導(dǎo)的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)信號(hào)通路而致心肌肥大作用可能是芪藶強(qiáng)心膠囊抑制慢性心衰進(jìn)程的分子機(jī)制之一。

［1］楊水祥，胡大一.心力衰竭的新機(jī)制和新策略研究進(jìn)展［J］.中國(guó)心血管病研究雜志，2005，3(6):17-21.

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△通訊作者

R285.5

B

1006-3250(2010)07-0560-03

2010-01-20