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JAK1在支氣管氣道腫瘤發(fā)生和發(fā)展中作用

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目的探討細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中JAK1在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中作用。方法采用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)32例初治支氣管氣道腫瘤患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞及32例健康人群外周血單個(gè)核細(xì)胞中JAK1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果JAK1在支氣管氣道腫瘤細(xì)胞的表達(dá)明顯比健康人群多。結(jié)論JAK1表達(dá)升高在支氣管氣道腫瘤發(fā)病中起重要作用，并與誘導(dǎo)治療療效相關(guān)，檢測(cè)JAK1 mRNA的表達(dá)，對(duì)指導(dǎo)支氣管氣道腫瘤治療轉(zhuǎn)歸及預(yù)后的判斷有一定意義。

支氣管氣道腫瘤;JAK1;RT-PCR;細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路

眾所周知，JAKs是許多細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子及干擾素的重要信號(hào)傳感器。細(xì)胞因子與受體結(jié)合，激活JAKs，JAKs活化后激活其傳導(dǎo)通路的下游信號(hào)，參與體內(nèi)多種疾病的發(fā)生發(fā)展。研究表明，JAKs參與了一條極為快速的，從膜到核的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等過程。JAKs家族參與的信號(hào)通路的持續(xù)激活與人類多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)。JAK1做為JAKs家族成員之一，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。支氣管氣道腫瘤是一種變應(yīng)性炎癥性疾病，多種炎性細(xì)胞和炎性介質(zhì)參與其發(fā)病，導(dǎo)致氣道可逆性收縮、氣道高反應(yīng)性、黏液分泌增加，長(zhǎng)期發(fā)展導(dǎo)致氣道重塑。JAK1功能活化亢進(jìn)是支氣管氣道腫瘤發(fā)病的重要基礎(chǔ)，蛋白酪氨酸激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在支氣管氣道腫瘤的發(fā)病中起重要作用。本研究旨在探討蛋白酪氨酸激酶JAK1在支氣管氣道腫瘤肺組織中的表達(dá)。

1 臨床資料

1.1 一般資料 本組所選擇32例初治支氣管氣道腫瘤患者均為我院2009年6月至2010年2月住院治療患者(觀察組)。其中男20例，女12例，18～68(平均38)歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《腫瘤診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》。正常對(duì)照組32例為健康志愿者，男19例，女13例，18～70(平均30)歲。兩組一般資料情況對(duì)比無顯著性差異，具有可比性(P＞0.05)。

1.2 總RNA的提取和鑒定 按產(chǎn)品說明用TRIZOL(美國Promega公司)提取細(xì)胞總RNA，1%瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA的完整性，用紫外分光光度儀進(jìn)行RNA定量和純度鑒定。

1.3 cDNA合成 采用隨機(jī)六聚引物(Promega公司)合成第1條鏈cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μl，細(xì)胞總 RNA 2μg，50 U Rnasin 0.5 μl，500 mg/L 隨機(jī)引物 1 μl，10 mmol/L dNTP 2 μl，5 × 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液 4 μl，200 uμAMV 逆轉(zhuǎn)錄酶200 U，余用焦碳酸二乙酯(DEPC)水補(bǔ)足。在37℃ 中反應(yīng)60 min，95℃反應(yīng)5 min后終止反應(yīng)。cDNA在-80℃保存或進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.4 引物設(shè)計(jì) 目的基因JAK1和管家基因磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)引物序列參照文獻(xiàn)，GAPDH上游引物:5-CGGGAAGCITGTCATCAATGG-3;下游引物:5-GGCAGAGADCASGGCATTGGACTG-3。登陸Genebank數(shù)據(jù)庫，JAK1序列號(hào)為NM002227，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)JAK1引物，JAK1上游引物:5-TGGAGGTAACCACATAGC-3;下游引物:5-CCGAGAACCCAAATAGTC-3。引物由北京生工基因技術(shù)有限公司合成。

1.5 擴(kuò)增條件 JAK1:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，54℃退火45 s，72℃延伸45 S，35個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸10 min。GAPDH的擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性60 s，58℃退火60 s，72℃延伸60 s，22個(gè)循環(huán)。最后 72℃延伸10 min。

1.6 PCR產(chǎn)物分析 取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物，2.5%瓊脂糖凝膠電泳(90 V，50 min)，溴化乙錠(EB)染色，并在讀膠儀 Alphalmager 1200上掃描分析JAK1與GAPDH的灰度比值進(jìn)行半定量分析。RT-PCR結(jié)果JAK1和GAPDH均有表達(dá)者定義為JAK1;JAK1 mRNA陰性表達(dá)，只有GAPDH陽性者定義為JAK1 mRNA陰性表達(dá)。

2 結(jié)果

JAK1的表達(dá)在兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具體情況見表1。

表1 兩組JAK1的表達(dá)情況對(duì)比(pg/ml，±s)

表1 兩組JAK1的表達(dá)情況對(duì)比(pg/ml，±s)

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3 討論

PTK是一組能催化底物蛋白酪氨酸殘基磷酸化的酶蛋白。依其基本特點(diǎn)分為受體型和非受體型兩類。受體型PTK主要介導(dǎo)一些生長(zhǎng)因子的信號(hào)傳導(dǎo)，非受體型PTK主要介導(dǎo)許多細(xì)胞因子受體，如白細(xì)胞介素和干擾素等的信號(hào)傳導(dǎo)，這些受體盡管缺乏酪氨酸激酶活性，但與配體結(jié)合后其近膜端能與非受體型酪氨酸激酶相互作用，而遠(yuǎn)膜端則有多個(gè)酪氨酸殘基能被活化的JAK磷酸化。此類受體能借助JAKs激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子，JAK家族包括JAK1、JAK2、JAK3 和 TYK2 等［1］。

JAK最早在惡性血液病中被研究，但隨著對(duì)JAKs通路深入研究，JAK1在實(shí)體腫瘤中的作用逐漸被重視。目前很多研究表明，JAK1在乳腺癌的發(fā)生、前列腺癌、腎臟惡性腫瘤的治療、頭頸部腫瘤的進(jìn)展，以及子宮平滑肌肉瘤和惡性黑色素瘤中起著重要作用［2-3］。

Neilson等發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中，PR不僅僅能激活JAK2，而且能激活JAK1。雖然JAK1激活的機(jī)制尚未明確，但是發(fā)現(xiàn)JAK1活化可引起下游的STAT 3活化和ERK高度活化，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Noda等對(duì)多種人頭頸部腫瘤細(xì)胞系研究中發(fā)現(xiàn)，外源性的給予G-CSF可增加腫瘤的浸潤(rùn)性。G-CSF受體陽性的頭頸部腫瘤，其浸潤(rùn)性也相對(duì)較高，此種機(jī)制可能是G-CSF引起JAKI的活化，導(dǎo)致JAK/ATAT通路的持續(xù)活化所致。此外，仍有很多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療與JAK1相關(guān)。Hayashi等發(fā)現(xiàn)，在人子宮平滑肌肉瘤中，JAK1的ATP結(jié)合區(qū)的G871E突變，可導(dǎo)致干擾素 治療耐藥。在惡性黑色素瘤中，發(fā)現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移與JAK1/PKCB通路以及JAK1/STAT5 通路的活化有關(guān)［4，5，6］。

支氣管氣道腫瘤形成中普遍存在JAK/STAT通路的異常，尤其是JAK/STAT信號(hào)通路的持續(xù)激活，JAK1通過對(duì)JAKs及下游蛋白分子的脫磷酸化負(fù)調(diào)控JAK/STAT通路。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，JAK1在支氣管氣道腫瘤細(xì)胞的表達(dá)明顯比健康人群多，說明JAK1表達(dá)升高在支氣管氣道腫瘤發(fā)病中起重要作用，并與誘導(dǎo)治療療效相關(guān)，檢測(cè)JAK1 mRNA的表達(dá)，對(duì)指導(dǎo)支氣管氣道腫瘤治療轉(zhuǎn)歸及預(yù)后的判斷有一定意義。

［1］Hayashi T，Kobayashi Y，Kohsaka S，et al.The mutation in the ATP-binding region of JAK1，identified in human uterine leiomyosarcomas，results in defective interferon-gamma inducibility of TAP1 and LMP2.Oncogene，2006，25(29):1016.

［2］Bianchini F，Mannini A，Mugnai G，et al.Expression of a metastatic phenotype in IFNs-primed/TNFalpha-activated B16 murine melanoma cells:role of JAK1/PKCdelta signal transduction factors.Clin Exp Metastasis，2006，23(3-4):203.

［3］Mirmohammadsadcgh A，Hassan M，Bardenheuer W，et al.STAT5 phosphorylation in malignant melanoma is important for survival and is mediated through SRC and JAK1 kinases.Invest Dermatol，2006，126(10):2272.

［4］Han Y，Amin H，F(xiàn)ranko B，et al.Loss of SHP1 enhances JAK3/STAT3 signaling and decreases proteosome degradation of JAK3 and NPM-ALK in ALK+anaplastic large-cell lymphoma.Blood，2006，108(8):2796-2803.

［5］HAN Yin，LUO Jian·ming，JIA Xiao hui，et al.The expression and clinical significance of hematopoietic cell phosphatase and cysteinyl aspartate-specific proteinase in leukemia.Chin J Intern Med，2006，45(5):363-365.

［6］韓穎，羅建民，賈曉輝，等.白血病患者造血細(xì)胞磷酸酶與半胱氨酸蛋白酶基因表達(dá)及其臨床意義.中華內(nèi)科雜志，2006，45(5):363-365.

110001 沈陽，中國醫(yī)科大學(xué)