孟箭 郭偉 張志愿 任國新 竺涵光 何悅 周曉健

（1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬徐州市中心醫(yī)院 口腔科，江蘇 徐州 221009；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院 口腔頜面外科，上海 200011）

腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）基因轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤引流淋巴結(jié)細胞（drainage node of lymphocytes，DNL）后發(fā)現(xiàn)其外緣性基因能夠表達，分泌高活性的TNF，在體外具有強大的抗腫瘤活性[1]。TNF-α基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的舌鱗癌DNL瘤周注射比靜脈輸注到達瘤體的濃度高[2-3]。但體內(nèi)是一個復(fù)雜的環(huán)境，體內(nèi)抑瘤效果尚不清楚。本實驗在建立人舌鱗癌SCID鼠移植瘤模型的基礎(chǔ)上，觀察局部應(yīng)用TNF-α基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的DNL以及聯(lián)合應(yīng)用低劑量平陽星（Pinyancin，PYC）對人舌鱗癌的抑瘤效果，并對其機制進行探討，以期為臨床免疫化療提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取由上海市腫瘤研究所動物房提供的SCID鼠15只，4～6周齡，體重18～24 g，在SPF條件下飼養(yǎng)。

1.2 制備舌鱗癌TNF/DNL

制備舌鱗癌TNF/DNL的方法見參考文獻[1]。

1.3 荷瘤SCID鼠模型的建立

人舌鱗癌Tca8113細胞株（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科）解凍復(fù)蘇，37℃、5%CO2條件下于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期貼壁生長的細胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，用PBS緩沖液洗滌3次，計數(shù)后配成濃度為每升1×1010個的腫瘤細胞懸液，給SCID鼠皮下注射0.2 mL。

1.4 實驗分組

將15只實驗動物隨機分為3組，即對照組、TNF/DNL加重組白細胞介素-2（recombinant interleukin-2，rIL-2）組和TNF/DNL加rIL-2加PYC組，每組5只。對照組在SCID鼠皮下注射等量生理鹽水。TNF/DNL加rIL-2組：在腫瘤接種12 h后于腫瘤部位注射濃度為每升5×1010個的TNF/DNL 0.2 mL，腹腔注射1×104U·mL-1rIL-2 0.2 mL。TNF/DNL加rIL-2加PYC組：腫瘤接種12 h后腹腔注射0.5 g·L-1的PYC 0.2 mL，12 h后接種部位注射濃度為每升5×1010個的TNF/DNL 0.2 mL，腹腔注射1×104U·mL-1rIL-2 0.2 mL。

1.5 移植瘤生長情況及抑瘤作用評價

荷瘤SCID鼠飼養(yǎng)在SPF環(huán)境中，每周觀測瘤體大小，第8周測量體積后處死，解剖稱重，按下列公式計算抑瘤率：抑瘤率（%）=（1-實驗組平均瘤重/對照組平均瘤重）×100%。

1.6 細胞凋亡超微結(jié)構(gòu)的觀察

1.6.1 電鏡檢查 TNF/DNL加rIL-2組移植瘤在4℃條件下將標本置于3%戊二醛固定液中浸泡24 h，用0.1 mol·L-1二甲砷酸鈉緩沖液漂洗72 h后用1%四氧化鋨固定2 h，乙醇逐級脫水后用環(huán)氧樹脂618定向包埋，切0.5 μm的中薄切片，甲苯胺藍染色后作光鏡定位觀察，根據(jù)光鏡定位制備70 μm超薄切片，經(jīng)醋酸雙氧鋰及檸檬酸鉛雙重電子染色后，用Hitachi-600透射電鏡觀察。

1.6.2 TUNEL法凋亡細胞原位標記 切片常規(guī)脫蠟至水，室溫下20 mg·L-1蛋白酶K消化25 min；置0.3%H2O2甲醇溶液處理1 h；0.1%TritonX-100溶液4 ℃ 2 min；加5 μL平衡液和45 μL含TDT酶的反應(yīng)液共50 μL（TUNEL試劑盒）37℃反應(yīng)1 h；滴加抗生素堿性磷酸酶抗體置于濕盒中37℃孵育30 min；DAB顯色，蘇木蘇復(fù)染，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，封蠟。未加脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶TdT的dUTP作陰性對照。結(jié)果判定標準：細胞核深棕褐色者為凋亡陽性細胞，計算凋亡細胞占總計數(shù)的百分比為凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）, 每份標本于40×10視野下隨機檢測10個視野。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SAS 10.0軟件包對每組的抑瘤率作兩兩比較；各組的AI用±s表示，對組間均數(shù)進行t檢驗比較組間差異。統(tǒng)計的顯著性水平設(shè)定為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組腫瘤的生長情況

對照組接種后第2周移植瘤體積開始增大，第3周體積增大迅速，第8周平均體積已達3.771 cm3；TNF/DNL加rIL-2組、TNF/DNL加rIL-2加PYC組接種后腫瘤體積增長緩慢，第8周時二者瘤體平均體積分別為1.422、0.334 cm3。對照組、TNF/DNL加rIL-2組和TNF/DNL加rIL-2加PYC組腫瘤重量分別為（2.988±0.454）、（1.086±0.407）、（0.272±0.097）g。第8周末TNF/DNL加rIL-2組和TNF/DNL加rIL-2加PYC組抑瘤率分別為63.65%、90.90%，二者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 電鏡觀察結(jié)果

TNF/DNL加rIL-2組看到典型的凋亡細胞，表現(xiàn)為胞核染色質(zhì)固縮，聚集在核的邊緣，呈半球狀，也可均勻平鋪于核膜下形成半月狀或塊狀，并可見凋亡小體，細胞漿內(nèi)各種細胞器基本正常（圖1、2）。

圖 1 TNF/DNL加rIL-2組凋亡細胞胞核染色質(zhì)固縮，呈塊狀TEM ×4 800Fig 1 Apoptotic chromatin condensation nuclei into a block in the TNF/DNL and rIL-2 group TEM ×4 800

圖 2 TNF/DNL加rIL-2組凋亡細胞胞核染色質(zhì)固縮，并可見凋亡小體 TEM ×3 810Fig 2 Apoptotic chromatin condensation nuclei with apoptotic bodies in the TNF/DNL and rIL-2 group TEM ×3810

2.3 TUNEL法檢測結(jié)果

TNF/DNL加rIL-2組和對照組的AI（每100個細胞中）分別為（10.06±2.62）、（3.26±1.51）個。TNF/DNL加rIL-2組與對照組相比，細胞核內(nèi)有明顯的標記物出現(xiàn)，AI明顯升高，與對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖3～5）。

圖 3 對照組鱗癌組織中有散在的凋亡細胞，胞核染色質(zhì)固縮積聚在核的邊緣，呈半球狀 TUNEL ×200Fig 3 Squamous cell carcinoma with scattered apoptotic cells in control group,and chromatin condensation nuclei in the nuclear accumulation of the edge into a hemispherical shape TUNEL ×200

圖 4 TNF/DNL加rIL-2組凋亡細胞數(shù)量較多 TUNEL ×200Fig 4 More apoptotic cells in the TNF/DNL and rIL-2 group TUNEL ×200

圖 5 TNF/DNL加rIL-2組凋亡細胞胞體縮小，細胞核深重褐色TUNEL ×400Fig 5 Bodies of apoptotic cells shrinked and nucleus were deep brown in the TNF/DNL and rIL-2 group TUNEL ×400

3 討論

近年來，由于腫瘤免疫學(xué)、分子生物學(xué)和基因工程的飛速發(fā)展，免疫效應(yīng)細胞和細胞因子在腫瘤治療中的作用越來越顯示出其重要性[4-6]。其中，TNF是目前抗腫瘤作用較肯定的細胞因子[5]。TNF具有多種免疫生物活性和很強的抗腫瘤作用，但人體因無法耐受常規(guī)治療劑量的TNF而限制其臨床應(yīng)用，利用細胞因子轉(zhuǎn)基因手段可將TNF基因通過TIL細胞的運載而達到腫瘤局部產(chǎn)生高濃度TNF因子，不僅可以解決機體耐受性問題，而且可顯著提高療效。Rosenberg[7]從1例惡性黑色素瘤的患者中分離出TIL，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染TNF基因，然后回輸給患者，這些TIL細胞可以聚集在腫瘤區(qū)域，產(chǎn)生TNF，對惡性黑色素瘤有一定的治療作用。白細胞介素-2激活的DNL細胞已被證實與腫瘤浸潤淋巴細胞具有相似的抗瘤效應(yīng)[8]。動物實驗表明，口腔癌DNL與低劑量的平陽霉素聯(lián)合應(yīng)用可增強其抗腫瘤作用[9]。TNF-α基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的DNL比未轉(zhuǎn)導(dǎo)組在體外具有更強大的殺瘤活性，研究結(jié)果提示TNF-α基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的DNL局部注射比靜脈輸注到達瘤體的濃度高?；诖耍緦嶒灢捎媚[瘤接種部位注射TNF/DNL，取得了較好的體內(nèi)抑瘤效果；腹腔應(yīng)用低劑量的平陽星，12 h后局部應(yīng)用TNF/DNL抑瘤效果更顯著。本實驗說明，TNF/DNL與平陽星聯(lián)合應(yīng)用在動物體內(nèi)能夠有效抑制舌鱗癌生長，提示TNF/DNL和平陽星聯(lián)合應(yīng)用可以對微小的腫瘤灶或殘留腫瘤起到有效的殺傷作用。

本實驗表明，TNF/DNL與低劑量的平陽星聯(lián)合應(yīng)用抗腫瘤作用增強，其主要機制可能是：平陽星為細胞周期非特異性藥物，對機體的免疫功能和造血功能無明顯影響，抗癌作用較強，不良反應(yīng)小。平陽星直接作用于瘤體，殺傷腫瘤細胞，減輕腫瘤負荷，使過繼免疫基因治療對較小腫瘤發(fā)揮有效的抗瘤作用?；熕幬锊粌H對腫瘤細胞殺傷，還可能對免疫效應(yīng)細胞產(chǎn)生殺傷，影響療效。平陽星經(jīng)靜脈注射半衰期為6～12 h，腹腔應(yīng)用低劑量的平陽星，12 h后注射TNF/DNL，則平陽星對TNF/DNL的活性較少抑制。提示臨床可以采用序貫給藥，即先通過腫瘤敏感性化療藥物大量殺傷腫瘤細胞，然后應(yīng)用免疫基因治療消滅殘存的癌細胞，加強其抑瘤效果。另一方面，某些化療藥物可使免疫效應(yīng)細胞聚集到腫瘤部位，其機制可能是化療藥物對腫瘤細胞表面抗原進行修飾，使LAK細胞容易攻擊[10]。

實驗證明[5，8，11]口腔癌DNL細胞可以誘發(fā)Tca8113細胞凋亡，而且TNF本身可以直接殺傷腫瘤細胞，也可誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。從細胞凋亡角度來分析TNF/DNL的治療作用，對進一步揭示其作用機制，提高療效具有重要意義。透射電鏡觀察顯示，TNF/DNL加rIL-2組腫瘤細胞有典型的凋亡細胞出現(xiàn)，其特征是細胞核體積縮小，染色質(zhì)濃縮致密，并沿核膜分布形成新月體狀和塊狀，細胞膜微絨毛消失，但細胞漿內(nèi)的各種細胞器基本正常，也可見較多的腫瘤細胞壞死。而且，TUNEL法檢測結(jié)果顯示TNF/DNL加rIL-2組細胞核內(nèi)有明顯的標記產(chǎn)物出現(xiàn)。TNF/DNL組比對照組AI增高（P＜0.05），說明除了通過直接殺傷和介導(dǎo)免疫反應(yīng)致腫瘤細胞壞死外，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡可能是TNF/DNL抗腫瘤作用的重要機制之一，但其中的調(diào)節(jié)機制尚需進一步研究。

[1] 李濤,邱蔚六,何榮根,等.腫瘤壞死因子-α基因修飾口腔鱗癌DNL體外抗腫瘤的實驗研究[J].中華口腔醫(yī)學(xué)雜志,1997,32（5）：262-264.LI Tao,QIU Wei-liu,HE Rong-gen,et al.Experimental study on antitumor effectin vitroof modified DNL of oral squamous cell carcinoma with TNF-α gene[J].Chin J Stomatol,1997,32（5）：262-264.

[2] 孟箭,郭偉,張志愿,等.靜脈輸注轉(zhuǎn)TNF基因的舌癌DNL細胞在動物體內(nèi)的分布[J].實用口腔醫(yī)學(xué)雜志,2002,18（5）：398-399.MENG Jian,GUO Wei,ZHANG Zhi-yuan,et al.Distributions of drainage node of lymphocytes obtained from tongue cancer and transduced with TNF gene after intravenous infusion in tumor bearing mice[J].J Pract Stomatol,2002,18（5）：398-399.

[3] 孟箭,郭偉,張志愿,等.實驗動物瘤周注射轉(zhuǎn)TNF-α基因的舌癌DNL在體內(nèi)分布的研究[J].口腔頜面外科雜志,2002,12（3）：223-225.MENG Jian,GUO Wei,ZHANG Zhi-yuan,et al.In vitrodistributions of DNL from tongue cancer transduced with TNF-α gene after local injection in tumor-bearing mice[J].J Oral Maxillofac Surg,2002,12（3）：223-225.

[4] Yu P,Fu YX.Tumor-infiltrating T lymphocytes：Friends or foes[J].Lab Invest,2006,86（3）：231-245.

[5] Younes A,Kadin ME.Emerging applications of the tumor necrosis factor family of ligands and receptors in cancer therapy[J].J Clin Oncol,2003,21（18）：3526-3534.

[6] Morgan RA,Dudley ME,Wunderlich JR,et al.Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes[J].Science,2006,314（5796）：126-129.

[7] Rosenberg SA.Gene therapy for cancer[J].JAMA,1992,268（17）：2416-2419.

[8] 郭偉,邱蔚六,何榮根.口腔癌引流區(qū)淋巴結(jié)細胞對人舌鱗癌細胞的殺傷機理[J].中華口腔醫(yī)學(xué)雜志,1995,30（3）：143-144.GUO Wei,QIU Wei-liu,HE Rong-gen.A preliminary study on the mechanism of againsthuman tongue cancer cell lin[J].Chin J Stomatol,1995,30（3）：143-144.

[9] 郭偉,何榮根,邱蔚六,等.舌鱗癌引流區(qū)淋巴結(jié)細胞聯(lián)合平陽霉素的抑瘤作用[J].上?？谇会t(yī)學(xué)雜志,1992,1（1）：40-43.GUO Wei,HE Rong-gen,QIU Wei-liu,et al.The antitumor effect of DNL/rIL-2 and Pingyangmycin on human tongue carcinoma（Tca8113） transplanted to nude mice[J].Shanghai J Stomatol,1992,1（1）：40-43.

[10] Aoki Y,Takakuwa K,Kodama S,et al.Use of adoptive transfer of tumor-infiltrating lymphocytes alone or in combination with cisplatin-containing chemotherapy in patients with epithelial ovarian cancer[J].Cancer Res,1991,51（7）：1934-1939.

[11] Skornick Y,Topalian S,Rosenberg SA.Comparative studies of the long-term growth of lymphocytes from tumor infiltrates,tumor-draining lymph nodes,and peripheral blood by repeatedin vitrostimulation with autologous tumor[J].J Biol Response Mod,1990,9（4）：431-438.