任思楣 俞 云佘 鳴 邵曉楓 師銳贊 彭洪薇 林 陽 張秀麗 張硯君 熊冬生

(中國醫(yī)學科學院血液病醫(yī)院血液學研究所實驗血液學國家重點實驗室,天津300020)

·免疫學技術與方法·

消減免疫法制備抗H L60、H L60/ADR表面抗原差異抗體①

任思楣 俞 云②佘 鳴 邵曉楓 師銳贊 彭洪薇 林 陽 張秀麗 張硯君 熊冬生

(中國醫(yī)學科學院血液病醫(yī)院血液學研究所實驗血液學國家重點實驗室,天津300020)

目的:建立可特異識別HL60和HL60/ADR細胞膜表面差異蛋白的抗體庫,制備單克隆抗體并研究其生物學活性。方法:通過Cp誘導的消減免疫法免疫BALB/c小鼠,采用傳統(tǒng)雜交瘤技術制備可特異識別兩種細胞差異膜蛋白的單克隆抗體;采用FACS和激光共聚焦顯微鏡鑒定其和兩種靶細胞結合的特異性和差異性。結果:獲得51株候選的差異抗體,成功篩選并純化其中一株單抗(5F6)。5F6與可特異穩(wěn)定的識別HL60/ADR細胞,結合率扣除本底為68.2%,而該抗體與HL60細胞的結合率為17%。結論:SI結合差異篩選的方法是制備差異抗體便捷可行的方法,所獲得的單克隆抗體與HL60和HL60/ADR細胞膜蛋白結合有特異性和差異性,實驗中所獲得的單抗是尋找腫瘤耐藥的新靶點和發(fā)現(xiàn)腫瘤耐藥新機制的工具,為研究這些問題開拓了新思路。

消減免疫;腫瘤耐藥;單克隆抗體;差異識別

腫瘤耐藥是腫瘤治療中的難題,也是目前國內(nèi)外醫(yī)學界研究的熱點。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的耐藥機制主要有:P-糖蛋白,多藥耐藥相關蛋白,包括拓撲異構酶、二氫葉酸還原酶、醛脫氫酶等酶類以及和凋亡相關的一些蛋白等等,其中能在臨床上得到證實甚至應用的卻很少,因而發(fā)現(xiàn)新的耐藥機制和耐藥新靶點迫在眉睫。本實驗采用消減免疫方法,獲得了數(shù)株可特異識別敏感腫瘤和耐藥腫瘤表面差異蛋白的單克隆抗體,為腫瘤多藥耐藥新靶點和新機制的發(fā)現(xiàn)奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和細胞系 小鼠SP2/0骨髓瘤細胞、H L60細胞系,耐阿霉素人急性白血病細胞系(H L60/ADR),耐藥倍數(shù)為130倍,均由本室保存; BALB/c小鼠(4～6周齡),購自中國軍事醫(yī)學科學院。

1.1.2 實驗試劑 RPMI1640(Hy CLIONEPIERCE)、HAT、HT、PEG 1450(Invitrogen);Cyclophosphamide (Cp)、Pristane、DAPI(Sigma);蛋白 G親和色譜柱(Pharmacia);羊抗鼠 IgG-FITC、胎牛血清(本所科技開發(fā)公司);羊抗鼠IgG-HRP(北京中山生物工程公司);BCA試劑盒(PIERCE)。

1.1.3 實驗儀器 激光共聚焦顯微鏡(Leica),流式細胞儀(FACSCalibur)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 細胞置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中,用含有100 ml/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)。以0.5μg/ml的劑量每四天加藥一次維持 HL60/ ADR的耐藥性,取處于對數(shù)生長期,生長狀態(tài)良好的細胞用于實驗。

1.2.2 動物的負向免疫誘導與抗血清效價檢測取雌性BALB/c小鼠,腹腔注射HL60細胞(5×106),除對照組小鼠外20分鐘后腹腔注射Cp(100 mg/kg小鼠體重),此后第24、48小時等量腹腔注射Cp兩次[1,2]。上述操作隔周重復一次,于第三次誘導后檢測動物血清效價:取小鼠尾血以PBS稀釋成不同濃度,與 HL60細胞4℃反應1小時,后與羊抗鼠(IgG-FITC)于4℃孵育30分鐘,洗凈二抗。用流式細胞儀檢測抗體與細胞的結合百分率及熒光強度,以小于對照組兩倍的熒光強度為陰性值,血清效價為對應的稀釋倍數(shù)。

1.2.3 動物免疫與細胞融合 最后一次負向免疫10天后,小鼠經(jīng)腹腔注射HL60/ADR細胞(5×106),隔周免疫一次,共3次。取小鼠尾血,分別以HL60和HL60/ADR為靶細胞檢測抗血清效價,方法及標準同上。選取以HL60為靶細胞抗血清效價最低且以HL60/ADR為靶細胞抗血清效價最高的小鼠做加強免疫。加強免疫以5×106HL60/ADR細胞經(jīng)尾靜脈注射,隨后進行融合和雜交瘤培養(yǎng)[3,4]。

1.2.4 陽性克隆篩選及克隆化培養(yǎng) 實驗采用活細胞間接標記法篩選:取細胞分泌的上清150μl分為兩份,分別與HL60和HL60/ADR為靶細胞于96孔板中4℃孵育1小時。棄上清液,PBS洗兩次。加入羊抗鼠IgG-FITC(20μl/孔)4℃反應30分鐘,棄上清液,以PBS洗三次,棄上清將每孔細胞稀釋至400 μl,上機檢測細胞分泌的上清與HL60和HL60/ADR兩種靶細胞的結合百分率。每孔細胞分泌的上清液檢測兩次,均符合如下標準可建株:(1)上清液與兩種靶細胞結合百分率之比大于2.5倍以上的瘤株; (2)單株靶細胞結合率≥30%,兩種靶細胞結合率之差≥20%的瘤株。

將符合標準的瘤株進行亞克隆培養(yǎng)和篩選,標準同上。篩選出可持續(xù)穩(wěn)定分泌有差異的特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)、凍存以備后續(xù)實驗研究。

1.2.5 單克隆抗體的制備及純化 腹腔注射雜交瘤細胞(2×106)于預先腹腔注射降植烷的BALB/c雌鼠,10～12天后取腹水,采用間接標記流式細胞儀測定效價。飽和硫酸銨預處理后,用蛋白G純化系統(tǒng)純化,分別用SDS-PAGE和BCA試劑盒檢驗其純度以及蛋白濃度。

1.2.6 流式細胞儀及激光共聚焦顯微鏡檢測單克隆抗體與靶細胞結合的差異性 采用FITC間接標記,流式細胞儀檢測純化抗體與HL60和HL60/ADR的結合百分率,方法同上。

將HL60、HL60/ADR細胞懸液涂于載玻片上,以丙酮和甲醇 (1∶1)固定,PBS洗兩遍,以胎牛血清室溫封閉20分鐘,洗兩遍,單克隆抗體4℃孵育1小時,FITC標記的羊抗鼠熒光二抗4℃孵育40分鐘, DAPI室溫孵育5分鐘,染細胞核。PBS洗三遍,用60%甘油封片于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 抗血清效價 經(jīng)HL60和Cp三次負向免疫誘導后,實驗組小鼠抗血清效價均低于400,對照組為12 800。實驗組小鼠經(jīng)HL60/ADR三次免疫后,以HL60/ADR為靶細胞的抗血清效價均高于以HL60為靶細胞的抗血清效價,3號小鼠以HL60/ADR為靶細胞的抗血清效價最高,高于12 800(表1)。取3號小鼠進行加強免疫及融合。

2.2 雜交瘤株的建立及差異篩選 按照上述方法及標準在首次篩選的87株雜交瘤中,我們發(fā)現(xiàn)有39株與 HL60/ADR的結合率高于 HL60,12株與HL60的結合率高于HL60/ADR(圖1A,B),有差異的瘤株共51計株,總差異率為58.62%。將這些抗體進行亞克隆培養(yǎng)。經(jīng)三次亞克隆培養(yǎng)、流式細胞儀交叉篩選后獲得數(shù)株可持續(xù)穩(wěn)定分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞。其中,克隆5F6生長最快,并且與兩種靶細胞的結合百分率差異大,我們首先對其進行亞克隆培養(yǎng),獲得一株雜交瘤細胞(克隆號5F6-C5-A12,簡稱5F6)用于抗體制備及純化。

2.3 單抗5F6的制備及純化 將雜交瘤細胞5F6接種于BALB/c小鼠腹腔,獲得腹水。飽和硫酸銨預處理,蛋白G純化系統(tǒng)純化,經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒定量,其濃度為1.6 mg/ml。SDS-PAGE電泳證明在非還原情況下抗體的分子量約為172 kD,經(jīng)還原后重鏈的分子量約為56 kD,輕鏈的分子量約為29 kD(圖2),純度大于95%。

表1 不同組小鼠的抗血清效價Tab.1 Titer of antiserum in different mice are represented

圖1 各株雜交瘤所分泌的抗體與 H L60,H L60/ADR兩種靶細胞的結合百分率Fig.1 Binding percentage of hybridoma antibodies based FACS assays

圖2 SDS-PAGE分析抗體5F6Fig.2 SDS-PAGEanalysis of monoclonal antibody 5F6

圖3 流式細胞儀檢測單抗5F6與H L60,H L60/ADR的細胞結合百分率Fig.3 Binding percentage of McAb 5F6 with H L60/ADRand H L60 cells by FACS

圖4 激光共聚焦觀察單抗5F6識別細胞膜抗原Fig.4 Immunofluorescence staining of membrane antigen

2.4 單抗5F6與HL60及HL60/ADR結合的差異性研究 純化后的單抗5F6分別與 HL60和 HL60/ ADR兩種靶細胞反應,經(jīng)流式細胞儀檢測,證明抗體與兩種細胞的結合率及熒光強度有顯著差異(圖3)。激光共聚焦顯微鏡下單抗 5F6與 HL60和HL60/ADR的熒光強度有顯著差異(圖4),說明此單克隆抗體確實能夠特異結合于HL60和HL60/ADR兩種靶細胞,且有明顯的差異。

3 討論

據(jù)統(tǒng)計90%以上的腫瘤患者死亡不同程度受到耐藥的影響,這個難題一直困擾著臨床化療工作。迄今已發(fā)現(xiàn)的腫瘤耐藥的機制并不能很好的解釋臨床耐藥的現(xiàn)象,其中能應用于臨床治療的更是少之又少。血液腫瘤的治療無法依靠手術切除,因而化療的耐藥問題在血液腫瘤的治療中顯得尤為突出。如何發(fā)現(xiàn)血液腫瘤上耐藥的新靶點和新機制是血液學工作者需要迫切解決的問題。

細胞膜蛋白在細胞間接觸、表面識別、信號轉導、酶活性和轉運方面都扮演著重要的角色,是理想的檢測和治療靶點。但由于細胞膜蛋白固有的疏水性和復雜的結構,許多膜蛋白很難選擇合適的溶解試劑,這使得直接研究膜蛋白非常困難。如何在血液腫瘤細胞膜上發(fā)現(xiàn)與耐藥相關的新靶點,進一步研究其功能和新的耐藥機制是本實驗首要突破的問題。

研究表明,由Cp誘導的SI,操作性和重復性更強,其耐受原和免疫原既可以是結構相似的多肽、蛋白質(zhì),也可以是生物學功能相似的細胞、病毒等[5,6]。Cp作為一種免疫抑制劑被用于一些免疫過程性疾病和骨髓移植時的免疫抑制,他可誘導動物耐受非自身抗原,這種耐受主要是基于Cp優(yōu)先清除抗原刺激性B細胞和T細胞的作用[7]。

HL60敏感株作為耐受原誘導動物免疫耐受,理論上受試動物應耐受敏感株表面抗原,用 HL60/ ADR免疫時動物只對耐藥株不同于敏感株表面的抗原產(chǎn)生免疫應答,但在實驗中我們篩選到了與敏感株結合率高于耐藥株的單克隆抗體。在Raymond的研究中[8],這種經(jīng)過消減免疫法制備的抗體優(yōu)先結合于耐受原的情況也曾出現(xiàn)過。這可能是由于這些單抗所針對的抗原表位是次要抗原決定簇,因而逃逸了由Cp介導的對T細胞的抑制。而這些表位同樣存在于免疫原HL60/ADR上,當再次接觸到這些表位時,B細胞依然會對這些表位產(chǎn)生免疫應答。若這些表位是HL60和HL60/ADR之間的差異表位,針對他們的單抗在后期的篩選過程中依然會作為差異抗體被篩選出來。

實驗采用SI方法結合流式細胞儀差異篩選抗體的方法,大大縮小了篩選抗體的工作量,縮短了篩選時間,所篩選到的抗體中按照我們自行設定的較高的差異標準,抗體中敏感株與耐藥株結合有差異的抗體比率仍可達到58.6%。我們在這些雜交瘤中選取生長狀態(tài)良好,與兩種靶細胞結合百分率差異大的六株克隆進行亞克隆培養(yǎng),最終獲得四株可穩(wěn)定分泌差異性抗體的雜交瘤細胞,并已穩(wěn)定培養(yǎng)。本實驗中,我們從四株已進行亞克隆并穩(wěn)定培養(yǎng)的克隆中選取克隆5F6-C5-A12進行抗體的制備和純化以及細胞結合功能的實驗。流式細胞儀和激光共聚焦顯微鏡分別在數(shù)量和形態(tài)驗證并鑒定了單抗5F6所識別的HL60和HL60/ADR上的抗原的差異性。本實驗未對5F6進行Ig亞類的鑒別。在以后的實驗中,我們將對其亞類進行鑒別,并用合適的方法進一步鑒定其抗原,研究抗原的作用機制。通過5F6的初步試驗,我們相信,所篩選得到的這些抗體可作為日后檢測和治療腫瘤耐藥的候選抗體,成為相關研究的有益工具,而相應的抗原則可能成為腫瘤多藥耐藥相關研究的新靶點。

1 Susan Ker-hwa Ou,Colin McDonald Paul H Pattersonet al.Comparisonof two techniques for t-argeting the production of monoclonal antibodies against particular antigens[J].J Immunolo-gical Methods,1991;145:111-118.

2 Heidi Major Sleister,A Gururaj Rao.Subtractive immunization:a tool for the generation of discr-iminatory antibodies to proteins of similar sequence [J].J Immunological Methods,2002;26(1-2):213-220.

3 邵曉楓,熊冬生,高瀛岱 et al.抗抗CD3 ScFv單克隆抗體的制備及鑒定[J].中國免疫學雜志,2007;23(2):142-145.

4 李洪濤,馬 波,王君偉.抗鴨胸腺細胞單克隆抗體的制備及其免疫組織化學研究[J].中國免疫學雜志,2008;24(1):42-46.

5 Dorrell C,abraha SL,Lanxon-cookson KMet al.Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers[J].Stem Cell Res,2008;Sep;1(3):183-194.

6 Lefebvre DJ,Costers S,Van Doorsselaere Jet al.Antigenic differences among porcine circovirus type 2 strains,as demonstrated by the use of monoclonal antibodies[J].Gen Virol,2008;89(1):177-187.

7 Andries Zijlstra,Jacqueline E,Testaet al.Targeting the proteome/epitome,implementation of sub-tractive immunization[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2003;303:733-744.

8 Raymond L,Mernaugh c,Heping Yan cet al.Production and characterization of mouse ureteric bud cell-specific rat hybridoma antibodies utilizing subtractive immunization and high-thr-oughput screening[J].J Immunological Methods,2005;306:115-127.

[收稿2009-07-18 修回2009-09-14]

(編輯 張曉舟)

Production of discrepant monoclonal antibody against HL60 and HL60/ADR by SI technique

REN Si-Mei,YU Yun,SHE Ming,SHAO Xiao-Feng,SHI Rui-Zan,PENG Hong-Wei,LIN Yang,ZHANG Xiu-Li,
ZHANG Yan-Jun,XIONGDong-Sheng.State Key Laboratory of Experimental Hematology,Institute of Hematology,CAMS&PUMC, Tianjin300020,China

Objective:T o prepare and characterize specific and discrepant mouse hybridoma antibodies on membrane of HL60 and HL60/ADR cell lines.Methods:BALB/c mice were immunized by subtractive immunization induced Cp(Cyclophosphamide).McAbswere prepared by hybridoma technique,screened and detected by FACS and LSCM.Results:51 candidates and discrepant antibodies were found,and one of them(5F6)was purified and identified.Conclusion:Combination of SI with discrepant screening method should facilitate the preparing and identifying discrepant McAbsfor identifying antibodies that can distinguish the differences in proteins expressed in HL60 and HL60/ADR, which is a significative and potential method in the research and target therapy associated drug-resistance.

Subtractive immunization;Tumor drug resistance;McAb;Discrepant protein

R392.33 文獻標識碼 A 文章編號 1000-484X(2010)02-0160-04

①本文受國家自然科學基金(30873091、30971291)和天津市科技發(fā)展項目(05YFGZGX02800 08ZCGHHZ00900)資助

②南京中醫(yī)藥大學藥學院,南京210029

任思楣(1981年-),女,在讀博士,主要從事腫瘤藥理學方面的研究,E-mail:simei-ren@163.com;

及指導教師:熊冬生(1961年-),男,教授,博士生導師主要從事腫瘤多藥耐藥和基因工程抗體方面的研究,E-mail:dsxiong1961@yahoo.com.cn。