高志云 揣 俠 藍(lán)佳明 劉貴霞 李 劍 張永紅 王永祥

(河北醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室,石家莊050017)

B細(xì)胞趨化因子對(duì)CVB3融合基因疫苗pcDNA3/C3d3-sVP1免疫效果的影響①

高志云 揣 俠 藍(lán)佳明 劉貴霞 李 劍 張永紅 王永祥

(河北醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室,石家莊050017)

目的:探討B(tài)細(xì)胞趨化因子(B-lymphocyte chemoattractant,BLC)對(duì)柯薩奇病毒B3融合基因疫苗pcDNA3/C3d3-sVP1免疫效果的影響。方法:將BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組,分別肌肉注射pcDNA3、pcDNA3/BLC、pcDNA3/C3d3-sVP1和含pcDNA3/BLC與pcDNA3/C3d3-sVP1的混合質(zhì)粒,于免疫后不同時(shí)間檢測(cè)小鼠血清的中和抗體滴度、特異性CT L殺傷活性;以LD50的CVB3病毒液感染已免疫小鼠,檢測(cè)小鼠血中病毒滴度,觀察存活情況以評(píng)價(jià)各種疫苗的免疫保護(hù)作用。結(jié)果:小鼠的中和抗體滴度隨免疫次數(shù)增加而提高,混合組中和抗體滴度(42.17±1.43)和特異性CT L殺傷率(41.3%±3.51%)均明顯高于pcDNA3/C3d3-sVP1組(P<0.05),而血中病毒滴度低于pcDNA3/C3d3-sVP1組;經(jīng)致死量CVB3感染后,pcDNA3/BLC和pcDNA3/ C3d3-sVP1混合免疫的小鼠生存率達(dá)44%,生存率高于其他各組。結(jié)論:BLC可顯著提高C3d3-sVP1基因誘導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答,增強(qiáng)基因疫苗對(duì)機(jī)體的免疫保護(hù)作用。

B細(xì)胞趨化因子;補(bǔ)體3d;柯薩奇病毒B3;基因疫苗

柯薩奇病毒B組(Coxsackievirus group B,CVB)是人類病毒性心肌炎的主要病原體,以CVB3最為重要,迄今尚無(wú)有效的預(yù)防措施。本室前期將編碼分泌型CVB3 VP1的基因和三拷貝C3d分子的基因拼接,構(gòu)建了靶向B細(xì)胞的基因疫苗pcDNA3/ C3d3-sVP1,免疫小鼠后能誘導(dǎo)較高水平的中和抗體,對(duì)致死量CVB3感染有一定保護(hù)力,但其免疫保護(hù)作用仍不理想[1]。推測(cè)與本疫苗缺乏對(duì)B細(xì)胞的有效趨化,導(dǎo)致成熟B細(xì)胞在肌肉組織中分布甚少有關(guān)。

[Abstract]淋巴細(xì)胞趨化因子(B-lymphocyte chemoattractant,BLC)是人B淋巴細(xì)胞的特異性趨化因子,并對(duì)部分T細(xì)胞也有趨化作用[2]。本研究將BLC真核表達(dá)質(zhì)粒作為基因佐劑,比較pcDNA3/C3d3-sVP1單獨(dú)免疫和BLC質(zhì)粒協(xié)同免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答,為研制新型CVB3基因疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與毒株 真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/BLC由Nancy HR博士和John RP教授惠贈(zèng);真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/C3d3-sVP1為河北醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室前期實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建[1]。采用堿裂解法大量制備質(zhì)粒DNA,并用PEG法對(duì)之進(jìn)行純化[3]。CVB3 Nancy株由本室保存。

1.2 免疫接種 純系BALB/c小鼠購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,4～6周齡,雄性,隨機(jī)分為4組,分別為pcDNA3組、pcDNA3/BLC組、pcDNA3/C3d3-sVP1組、pcDNA3/B組21只,各組高滲蔗糖溶液合組pcDNA3/外,其余各組間隔4周免疫14天眼眶靜的中和抗體滴

LC與pcDNA3/C3d3-sVP1混合組,每于小鼠右側(cè)大腿股四頭肌處注射25% 100μl,30分鐘后原位注射質(zhì)粒,除混BLC與pcDNA3/C3d3-sVP1各50μg/只劑量為100μg/只,注射前將質(zhì)粒混勻, 1次,共免疫3次。每次于接種后第脈取血,采用微量中和試驗(yàn)法檢測(cè)血清度。

1.3 特異性CT L檢測(cè) 第三次免疫后2周,每組取3只小鼠處死,無(wú)菌取脾。將脾淋巴細(xì)胞用 IL-2、ConA和滅活的CVB3體外刺激3天,作為效應(yīng)細(xì)胞。用經(jīng)滅活的CVB3體外刺激1天的SP2/0細(xì)胞作為靶細(xì)胞。以效靶比為40∶1進(jìn)行實(shí)驗(yàn),靶細(xì)胞以含10%新生牛血清的1640培養(yǎng)液稀釋至1×105ml-1,加入96孔板中,每孔100μl,每孔加入效應(yīng)細(xì)胞100 μl,同時(shí)加入 IL-2、ConA和滅活的CVB3刺激,于37℃,5%CO2孵箱中培養(yǎng)24小時(shí),采用CCK-8(cell counting kit-8,購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所)法檢測(cè)脾細(xì)胞殺傷活性,具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。同時(shí)設(shè)效應(yīng)細(xì)胞孔和靶細(xì)胞孔各3復(fù)孔。殺傷率(%)=[1-(效靶A值-效應(yīng)細(xì)胞A值)/靶細(xì)胞A值]×100%。

1.4 病毒的增殖和效價(jià)滴定 按常規(guī)在Hela細(xì)胞上培養(yǎng)CVB3,將病毒10倍遞次(10-1～10-10)稀釋; 18～20周齡BALB/c小鼠56只,按每組8只分成7組,分別注射10-4～10-107個(gè)稀釋度的病毒,每只0.2 ml;逐日觀察記錄動(dòng)物死亡數(shù),根據(jù) Reed-Muench法,計(jì)算LD50。

1.5 免疫小鼠的病毒感染 在小鼠3次免疫后第3周,每組取3只小鼠,腹腔注射含3 LD50的CVB3病毒液各0.2 ml。于注射后第7天,檢測(cè)血中病毒滴度。同時(shí),每組剩余的15只小鼠腹腔注射含4 LD50的CVB3各0.2 ml,觀察小鼠存活情況至注射后第14天,用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行生存分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件處理,以±s表示,中和抗體、病毒滴度和CT L殺傷率采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn);小鼠生存率和生存時(shí)間分別采用行×列表資料的Fisher確切概率法和Kaplan-Meier生存分析法。

2 結(jié)果

2.1 血清中和抗體水平 各組各次免疫后血清中和抗體平均滴度見(jiàn)表1。從表中可以看出,pcDNA3/ C3d3-sVP1組、pcDNA3/BLC與 pcDNA3/C3d3-sVP1混合組抗體滴度隨免疫次數(shù)的增加而提高,經(jīng)單因素方差分析表明,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。第3次免疫后,混合組的抗體效價(jià)最高,經(jīng) t檢驗(yàn),除pcDNA3組與pcDNA3/BLC組相比差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外,其余各組兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。混合組血清中和抗體平均滴度高于pcDNA3/C3d3-sVP1組。

2.2 CVB3特異性CT L活性 效靶比為40∶1時(shí),混合組的殺傷率為(41.3%±3.51%)高于pcDNA3組17.0%±2.00%)、pcDNA3/BLC組(20.0%±1.29%)和pcDNA3/C3d3-sVP1組(36.3%±2.52%)?；旌辖M殺傷率高于其它各組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01),見(jiàn)圖1。

2.3 血中病毒CVB3滴度測(cè)定 pcDNA3/BLC+ pcDNA3/C3d3-sVP1混合組小鼠血中病毒滴度為(2.16±0.12)低于pcDNA3組 (4.83±0.21)、pcDNA3/BLC組 (4.43±0.23)和pcDNA3/C3d3-sVP1組(2.50±0.31)。混合組和其它各組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 中和抗體平均滴度(±s)Tab.1 Mean neutralizing antibody titers(±s)

表1 中和抗體平均滴度(±s)Tab.1 Mean neutralizing antibody titers(±s)

Note:After the third immunization:1)Compared with pcDNA3/C3d3-sVP1 (P<0.01).

Groups After the first immunization After the second immunization After the third immunization pcDNA3 <1∶5 <1∶5 <1∶5 pcDNA3/BLC <1∶5 <1∶5 <1∶5 pcDNA3/C3d3-sVP1 7.94±1.41 19.95±1.52 31.62±1.41 pcDNA3/BLC+ pcDNA3/C3d3-sVP1 8.41±1.37 23.71±1.54 42.17±1.431)

2.4 小鼠注射CVB3后的生存情況 小鼠在接種CVB3第3天起開(kāi)始發(fā)病,表現(xiàn)為行動(dòng)遲緩、精神萎靡、毛發(fā)打綹,進(jìn)食量下降,第4天開(kāi)始死亡。各組在21天后的生存率分別為:混合組44%,pcDNA3/ sVP1-C3d3組33%,pcDNA3組和pcDNA3/BLC組無(wú)生存。用 Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析,生存率曲線如圖2所示,pcDNA3/BLC+pcDNA3/C3d3-sVP1混合組生存率高于pcDNA3組和pcDNA3/BLC組(P<0.05),但與pcDNA3/C3d3-sVP1組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 不同組小鼠的CTL應(yīng)答Fig.1 The CTL response of BALB/c mice in different groups

圖2 4 LD50攻擊后小鼠生存曲線Fig.2 Survival curve of BALB/c mice challenged with 4 LD50CVB3

3 討論

有研究顯示,三拷貝C3d分子與抗原偶聯(lián)后可增強(qiáng)抗原的免疫原性。這主要是由于C3d與B細(xì)胞上的受體CR2結(jié)合可為抗原與B細(xì)胞受體的交聯(lián)提供共刺激信號(hào),降低B細(xì)胞的活化閾值,促進(jìn)抗體的親和力成熟,調(diào)節(jié)B細(xì)胞與T細(xì)胞之間的相互作用,從而提高了疫苗的免疫原性。我們前期實(shí)驗(yàn)將編碼分泌型CVB3 VP1的基因和三拷貝C3d分子的基因拼接,構(gòu)建了靶向B細(xì)胞的基因疫苗pcDNA3/C3d3-sVP1,免疫小鼠后獲得了較高水平的中和抗體和特異性CT L殺傷活性,但免疫保護(hù)作用仍未能達(dá)到滿意的效果,推測(cè)其原因之一可能是C3d3雖然能將分泌到細(xì)胞外的VP1抗原靶向提呈,被具有C3d受體的抗原提呈細(xì)胞-B細(xì)胞捕獲,但由于成熟B細(xì)胞在肌肉組織中分布較少,即缺乏對(duì)B細(xì)胞的有效趨化而導(dǎo)致免疫效果不理想。

[Abstract]LC是唯一有選擇性吸引B淋巴細(xì)胞作用的趨化因子,屬于CXC類亞家族,首先在1998年發(fā)現(xiàn),主要來(lái)源于脾、胸腺、淋巴結(jié)、闌尾等器官,其受體CXCR5分布在所有的外周成熟B細(xì)胞和少量的T細(xì)胞亞型上,通過(guò)BLC與受體結(jié)合可特異性趨化B細(xì)胞,并能促進(jìn)其分化成熟[2,4]。有研究顯示[5],經(jīng)BLC修飾的弱免疫原性的抗原其免疫原性明顯增強(qiáng),故通過(guò)局部過(guò)表達(dá)BLC,促進(jìn)B細(xì)胞的游走和激活,而后C3d偶聯(lián)抗原可以與表達(dá)在B細(xì)胞和濾泡樹(shù)突狀細(xì)胞的CR2非特異性結(jié)合,被CR2+細(xì)胞內(nèi)吞,促進(jìn)了通過(guò)MHCⅡ類途徑的抗原提呈。而且,BLC能夠趨化特異抗原記憶性B細(xì)胞進(jìn)入次級(jí)淋巴器官,迅速產(chǎn)生抗體[6]。本研究表明,混合組小鼠中和抗體滴度明顯高于其他組;用致死量病毒感染后,血中病毒滴度顯著降低,保護(hù)率高于其他各組;還可提高特異性細(xì)胞免疫水平。

綜上所述,BLC與核酸疫苗pcDNA3/C3d3-sVP1的聯(lián)合免疫可顯著提高疫苗的免疫效果,提示BLC作為一種新型的基因佐劑在抗CVB3感染免疫中具有良好的應(yīng)用前景,為進(jìn)一步研制高效的CVB3 DNA疫苗提供了基礎(chǔ)。

1 趙 娜,韓小艷,王曉凌 et al.C3d對(duì)分泌型柯薩奇病毒B組3型VP1DNA疫苗的免疫增強(qiáng)作用[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2007;87(36): 2561-2563.

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[收稿2009-06-03 修回2009-09-29]

(編輯 倪 鵬)

The influence of B-lymphocyte chemoattractant on the immune response of CVB3 fusion gene vaccine pcDNA3/C3d3-sVP1

G AO Zhi-Yun,CHUAI Xia,LAN Jia-Ming,LIU Gui-Xia,LI Jian,ZHANG Yong-Hong,WANG Yong-Xiang.Department of Pathogenic Biology,Hebei Medical University,Shijiazhuang050017,China

Objective:T o investigate the influence of B-lymphocyte chemoattractant on the immune response of CVB3 fusion gene vaccine pcDNA3/C3d3-sVP1.Methods:BALB/c mice were divided into 4 groups randomly,and injected intramuscularlywith pcDNA3,pcDNA3/ BLC,pcDNA3/C3d3-sVP1 and the combination with the plasmid pcDNA3/BLC and pcDNA3/C3d3-sVP1.At a certain time,they were measured for the titersfor neutralizing antibodies,specific CT L cytotoxic activity.The protective efficacyof DNA vaccinations was evaluated by titers of blood viruses and survival rate.Results:The titers for antibodies increased with the time of inoculation.More specifically,the antibody titers (42.17±1.43)and the specific CT L cytotoxic activity(41.3%±3.51%)of the mice in the combination group were remarkably stronger than in the mice with pcDNA3/C3d3-sVP1(P<0.05),but the virus titers of blood was lower.After lethal CVB3 challenge,the protection of mice from death in the combination group with the plasmid pcDNA3/BLC and pcDNA3/C3d3-sVP1 was 44%.Survival curves indicated that the survive state of combination group was better than others.Conclusion:BLC can strongly enhance the specific immunity induced by C3d3-sVP1.

B-lymphocyte chemoattractant;Complement 3d;Coxsackieviruses B3;Gene vaccine

R373.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-484X(2010)02-0117-03

①本文為河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.08276101D-93)

高志云(1978年-),女,碩士,講師,主要從事病毒學(xué)研究,E-mail:gxfc-9879@163.com;

及指導(dǎo)教師:王永祥(1949年-),男,教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事病毒學(xué)研究,E-mail:wangyongxiang1@ yahoo.com.cn。