盧 曉 田建偉劉北一侯曉睿 朱 平 侯凡凡富 寧

(南方醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室,廣州510515)

針對(duì)晚期氧化蛋白產(chǎn)物的抗體制備與應(yīng)用①

盧 曉 田建偉②劉北一③侯曉睿 朱 平 侯凡凡②富 寧

(南方醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室,廣州510515)

目的:制備特異性識(shí)別晚期氧化蛋白產(chǎn)物(Advanced oxidation protein products,AOPP)的多克隆抗體,為研究AOPP的致病機(jī)理及與臨床病情相關(guān)性提供有效工具。方法:用次氯酸氧化家兔血清白蛋白以獲得AOPP-RSA,以此為免疫原免疫家兔,親和層析純化免疫血清,ELISA鑒定多克隆抗體的效價(jià)及特異性,Western blot檢測(cè)慢性腎臟病(chronic kidney disease, CK D)患者血漿中AOPP,免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腎組織中AOPP分布與定位。結(jié)果:獲得效價(jià)達(dá)10-6的抗AOPP免疫血清,純化抗體可特異地與不同種屬來源的氧化修飾白蛋白結(jié)合,而與正常白蛋白及糖基化蛋白終產(chǎn)物無交叉反應(yīng)。該抗體可識(shí)別人血漿中的AOPP,可特異地與大鼠CK D模型及各種炎癥性CK D患者腎組織成份反應(yīng)。結(jié)論:成功制備了可與不同種屬AOPP結(jié)合的特異性多克隆抗體,并首次用于檢測(cè)存在于CK D患者血漿、腎組織及模型動(dòng)物腎組織中的AOPP,為深入研究AOPP的病理作用及其在組織定位提供了有效工具。

晚期氧化蛋白產(chǎn)物;多克隆抗體;慢性腎臟病

晚期氧化蛋白產(chǎn)物(Advanced oxidation protein products,AOPP)是體內(nèi)氧化應(yīng)激過程中生成的一類含雙酪氨酸的蛋白質(zhì)交聯(lián)物,血漿AOPP主要由白蛋白攜帶。循環(huán)AOPP水平增高最先在慢性腎功能衰竭、腹膜透析的患者中被發(fā)現(xiàn),隨后在糖尿病、肥胖或代謝綜合征、動(dòng)脈粥樣硬化等多種常見疾病中被證實(shí)[1-4]。AOPP潴留還見于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎等免疫炎癥性疾病和惡性腫瘤(結(jié)腸、直腸癌、乳腺癌等),被認(rèn)為是體內(nèi)氧化應(yīng)激的敏感生物學(xué)標(biāo)志[1,4,5]。

近年不斷增加的研究證據(jù)表明,血漿AOPP水平增高促使該分子在腎臟和血管等組織中沉積并與慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CK D)及動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6-8]。慢性AOPP負(fù)荷促進(jìn)糖尿病動(dòng)物腎臟的炎癥反應(yīng)和腎組織損傷,促使CK D模型的腎臟炎癥和纖維化,并促使高脂血癥動(dòng)物發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化性病變[6-8]。這些研究結(jié)果均表明,AOPP潴留不僅是反映體內(nèi)氧化應(yīng)激的指標(biāo),其本身可能是一類促進(jìn)組織炎癥和纖維化的生物致病分子。深入探討AOPP在組織中的分布及其與病變的關(guān)系對(duì)于闡明AOPP致病的分子基礎(chǔ)至關(guān)重要,并有可能為上述疾病的發(fā)生發(fā)展提供新的生物學(xué)標(biāo)志或干預(yù)靶標(biāo)。

然而,檢測(cè)組織中AOPP水平尚缺乏理想方法?；贏OPP結(jié)構(gòu)含雙酪氨酸,在酸性條件下于340 nm處有一特異吸收峰。故目前通常采用將待測(cè)血漿樣本或組織標(biāo)本制成勻漿,而后用分光光度計(jì)分析340 nm處吸光度值以反映標(biāo)本中AOPP水平[6-9]。此法雖然簡便,但存在以下缺點(diǎn):①比色法受血脂、纖維蛋白的干擾而影響其準(zhǔn)確性[10,11];②無法觀察AOPP在病變組織(或細(xì)胞)中的定位;③分析所需組織量較多,臨床活檢標(biāo)本難以達(dá)到要求。

為了克服以上缺點(diǎn),我們采用體外次氯酸修飾的白蛋白作為抗原,成功制備了特異性識(shí)別AOPP的多克隆抗體,并通過免疫組織化學(xué)染色首次證實(shí)該抗體可有效識(shí)別AOPP在腎臟組織的沉積和分布,為深入研究AOPP這種內(nèi)源性致病分子提供了有用的工具。

1 材料與方法

1.1 試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 兔血清白蛋白(Rabbit serum albumin,RSA)、人血清白蛋白(Human serum albumin, HSA)、鼠血清白蛋白(Mouse serum albumin,MSA)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑及Carboxymethyl-HSA (CML-HSA)、glycolaldehyde-HSA(G A-HSA)均購自Sigma公司,Detoxi-Gel去內(nèi)毒素凝膠柱購自 Pierce公司。CNBr活化的Sepharose 4B購自GE公司。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。新西蘭家兔(2.5±0.25千克),購于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 無內(nèi)毒素AOPP-RSA的制備及定量 參考Witko-Sarsat等[1]報(bào)道方法制備,將 RSA與次氯酸(HOCL)以1/140的摩爾比例混合室溫反應(yīng)30分鐘, PBS透析24小時(shí)去除殘留次氯酸,樣品經(jīng)Detoxi-Gel凝膠柱去除內(nèi)毒素,所獲樣品內(nèi)毒素水平低于0.025 EU/ml。同時(shí)按上述方法制備AOPP-MSA、AOPP-BSA、AOPP-HSA。

[Abstract]OPP的定量參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行,取10μl 1.16 mol/L KI、20μl醋酸,各加入到200μl氯胺T(0～100 μmol/L)溶液中,作為標(biāo)準(zhǔn)品。樣品測(cè)量則取樣品200μl置于96孔板,加入20μl醋酸,立即測(cè)340 nm的吸光度值。依此方法計(jì)算得AOPP-RSA中AOPP的含量為(4.3±0.6)nmol/mg蛋白,而未修飾的RSA中AOPP含量為(0.2±0.02)nmol/mg蛋白。

1.3 兔抗AOPP血清的制備 采用常規(guī)免疫方式,即取AOPP-RSA 2 g/L加等體積弗氏完全佐劑充分乳化后,于家兔背部皮下多點(diǎn)及腳墊免疫,間隔3周再以AOPP-RSA 2 g/L加等體積弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)免疫。爾后每隔2周重復(fù)免疫,每次免疫后7天抽取少許靜脈血分離血清,檢測(cè)效價(jià),至效價(jià)達(dá)10-5以上后,采血分離血清。

1.4 抗AOPP抗體的純化 將AOPP-BSA 10 mg與CNBr活化的Sepharose 4B偶聯(lián),按常規(guī)方法制備親和層析柱。4℃條件下,用0.01 mol/L PBS(含0.5 mol/L NaCl)溶液洗柱并平衡,加入PBS稀釋的免疫血清,上樣速度1 ml/min。PBS充分流洗后以0.1 mol/L(pH2.8)甘氨酸緩沖液洗脫。收集洗脫液,立即用1/20體積的1 mol/L Tris-HCl(pH9.0)中和并透析至PBS中,BCA法進(jìn)行蛋白定量。

1.5 抗AOPP抗體的效價(jià)和特異性鑒定 以AOPPRSA 10 mg/L包被酶標(biāo)板,酪蛋白封閉液(1L溶液中包含Tris 1.21 g、明膠2 g、蔗糖20 g、硫柳汞0.2 g、酪蛋白2.5 g)封閉后,加入以1∶1 000起始倍比稀釋的免疫血清,37℃孵育30分鐘后加入HRP-羊抗兔多抗(1∶5 000稀釋,北京鼎國生物公司),37℃30分鐘TMB底物顯色,2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。測(cè)定OD 450值。

分別將 HOCL氧化的人血清白蛋白(AOPPHSA)、鼠血清白蛋白(AOPP-MSA)、兔血清白蛋白(AOPP-RSA)(同時(shí)以各種屬非氧化白蛋白為陰性對(duì)照)、晚期糖基化終產(chǎn)物(Advanced glycation end product,AGE)CML-HSA和G A-HSA以10 mg/L 4℃過夜包被酶標(biāo)板,酪蛋白封閉液封閉后,依次加入純化的抗AOPP多克隆抗體5 mg/L、HRP-羊抗兔多抗,反應(yīng)條件均為37℃30分鐘,TMB底物顯色,2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。測(cè)定OD 450值。

1.6 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳以及Western blot

配制3.9%積層膠、7.5%分離膠(試劑中不含SDS、β-巰基乙醇),將HSA(Sigma)、正常人(年齡20～30歲,n=4)及慢性腎功能衰竭患者血漿(n=4)樣品加入泳道(每孔加入20μg蛋白),100 V電泳6小時(shí)后,轉(zhuǎn)膜,以10%脫脂奶封閉PVDF膜,4℃過夜,依次加入兔抗AOPP多抗(10 mg/L)、HRP-羊抗兔多抗,ECL鑒定。

1.7 免疫組織化學(xué) 將CK D模型大鼠腎(以正常大鼠腎臟為對(duì)照)、不同腎臟疾病患者腎活檢組織行石蠟切片,常規(guī)脫蠟,置 0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)中微波抗原修復(fù),分別滴加0.3%H2O2-甲醇溶液,室溫避光孵育20分鐘,正常山羊IgG封閉(100 mg/L,4℃過夜),抗AOPP多抗(10 mg/L,室溫30分鐘)、HRP-羊抗兔多抗(室溫,30分鐘),顯微鏡下控制DAB顯色,蘇木素復(fù)染,中性樹膠封固。免疫組化染色過程中,每例均以正常兔IgG作為陰性對(duì)照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 上述所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次以上,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為±s,用SPSS10.0軟件進(jìn)行隨機(jī)方差分析(one-way ANOVA)。

2 結(jié)果

2.1 免疫血清效價(jià)及其識(shí)別AOPP的特異性 如圖1所示抗血清與AOPP-RSA結(jié)合的效價(jià)為1.0× 10-6;與AOPP-HSA結(jié)合效價(jià)達(dá)2.56×10-5,與非氧化型HSA無交叉反應(yīng)。初步確定免疫血清特異性識(shí)別AOPP-RSA和AOPP-HSA。

圖1 免疫血清效價(jià)測(cè)定Fig.1 Titers of anti-AOPP sera

圖2 抗AOPP多抗與不同種屬來源的氧化白蛋白特異性結(jié)合Fig.2 Indirect ELISA showing the reactivity of the polyclonal antibodies to AOPP-albumin from different genus

圖3 基于非變性電泳的Western blot鑒定健康者及CK D患者血漿中AOPPFig.3 Detection of plasma AOPP from healthy donors and CK D patients by Western blot based on native PAGE

為進(jìn)一步鑒定制備的抗體可特異性識(shí)別HOCL氧化的基團(tuán),我們以親和層析純化兔抗AOPP多抗,間接ELISA結(jié)果顯示:純化的多抗與AOPP-MSA、AOPP-RSA、AOPP-BSA和AOPP-HSA都能結(jié)合,而與各種正常白蛋白及糖化修飾白蛋白(CML-HSA,G AHSA)均無交叉反應(yīng)(P<0.001)(圖2)。提示我們所獲得的抗體針對(duì)各種氧化型蛋白的共同氧化基團(tuán)。鑒于AOPP結(jié)構(gòu)以雙酪氨酸為主形成的白蛋白聚體,如果在變性與還原條件下進(jìn)行PAGE及后續(xù)的Western blot則可能導(dǎo)致制備的多抗無法識(shí)別氧化基團(tuán),因此我們采用基于Native PAGE的Western blot,結(jié)果顯示該多抗僅與CK D患者血漿蛋白高分子量聚集區(qū)域結(jié)合(非單一條帶),而與商品人血漿白蛋白及健康者血漿成分無交叉反應(yīng)(圖3)。

2.2 CK D大鼠腎組織及CK D患者腎組織免疫組織化學(xué)染色 CK D大鼠腎組織切片:免疫組化染色可見AOPP沉積,主要分布于腎小管(圖4A箭頭所示)。非免疫IgG不能識(shí)別CK D大鼠腎組織中沉積的AOPP(圖4B)。正常大鼠腎組織抗AOPP抗體染色陰性(圖4C)。

圖4 抗AOPP多抗免疫組化染色CK D大鼠腎組織Fig.4 The deposition of AOPP in renal tissues of CK D rat detected by immunohistochemistry using anti-AOPP antibody

圖5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)AOPP在不同CK D患者腎組織中沉積部位不同F(xiàn)ig.5 The deposition of AOPP in in renal tissues of CK D patients detected by immunohistochemistry using anti-AOPP antibody

對(duì)各種CK D患者腎活檢組織切片進(jìn)行抗AOPP抗體免疫組化染色。結(jié)果顯示:①糖尿病腎病伴大量蛋白尿者腎小管上皮細(xì)胞間可見明顯的AOPP沉積,腎小管管腔中可見含AOPP的蛋白管型(圖5A箭頭所示);而非免疫的兔IgG不能與腎組織(來自于糖尿病腎病患者)反應(yīng)(圖5B)。②在炎癥和增生性腎小球疾病,如過敏性紫癜腎炎、IgA腎病慢性腎臟病中,AOPP沉積主要見于腎小球,也可見于腎小管(圖5C、D箭頭所示)。非炎癥性腎小球疾病如微小病變,腎組織中未見AOPP沉積(圖5E)。上述結(jié)果表明在針對(duì)氧化代謝紊亂的腎組織,抗AOPP抗體陽性染色是特異性的。

3 討論

本項(xiàng)研究應(yīng)用免疫學(xué)方法成功制備了抗AOPP多克隆抗體。應(yīng)用該抗體證實(shí)了血漿AOPP的存在,并用免疫組化證明了AOPP在大鼠和人類CK D腎組織中的沉積及定位。這些結(jié)果尚屬首次報(bào)道。

已知?jiǎng)用}粥樣硬化、慢性腎功能不全等存在AOPP潴留的疾病往往同時(shí)伴有高脂血癥。高甘油三酯導(dǎo)致樣本濁度增加,從而過高估計(jì)AOPP水平[10]。Anderstam等[12]利用硫酸葡聚糖沉淀樣本中的甘油三酯以克服這一缺點(diǎn),但該法需要特殊的試劑盒并使AOPP測(cè)定值也降低38%。此外,反復(fù)凍融后致樣本濁度增高也影響AOPP檢測(cè)。因此目前尚無能夠準(zhǔn)確而簡便地判斷AOPP水平的臨床檢測(cè)方法?；谔禺愋钥乖贵w反應(yīng)的檢測(cè)方法可有效避免非抗原因素的干擾,我們制備了高效價(jià)的兔抗AOPP多克隆抗體。實(shí)驗(yàn)證實(shí),該抗體可識(shí)別被HOCL氧化修飾的不同種屬的白蛋白,而與非氧化白蛋白不反應(yīng)(圖1);此外,該抗體也可與次氯酸氧化的球蛋白、人低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein,LDL)反應(yīng),但不與非氧化型球蛋白及Cu2+氧化修飾的LDL反應(yīng)(上述數(shù)據(jù)未在圖中顯示)。CK D患者體內(nèi)除AOPP外還存在其他形式的白蛋白修飾,其中最主要的是蛋白質(zhì)糖基化修飾產(chǎn)物——晚期糖基化修飾蛋白(AGE)。近期的研究表明,AOPP和AGE的受體都是人晚期糖基化終產(chǎn)物受體(human receptor for advanced glycation end product,RAGE)[13],說明在結(jié)構(gòu)上AOPP和AGE具有相似性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該抗體與AGE主要成分CML-白蛋白和G A-白蛋白無交叉反應(yīng)(圖2),證實(shí)我們制備的抗體特異性識(shí)別被HOCL修飾白蛋白的氧化基團(tuán)。Western blot的結(jié)果顯示純化的抗AOPP抗體能特異地與慢性腎衰患者血漿中蛋白高分子聚合物結(jié)合,但并非單一條帶,推測(cè)由于患者血漿中可能存在不同程度的氧化蛋白所致的蛋白聚合體,而我們制備的多抗可以識(shí)別氧化程度和聚合程度各異的蛋白(圖3)。盡管抗AOPP抗體針對(duì)的抗原決定簇尚有待確定,但上述資料提示,這是一種特異性識(shí)別AOPP特定結(jié)構(gòu)的抗體,可以用于下一步建立免疫學(xué)方法去檢測(cè)循環(huán)和組織中的AOPP水平。

以往研究已證實(shí),AOPP修飾的白蛋白對(duì)組織細(xì)胞具有炎癥介質(zhì)作用[14-16]。郭志堅(jiān)等[13]的工作顯示我們制備的多抗在體外實(shí)驗(yàn)中拮抗AOPP引起的人內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激,提示它具有中和活性,可用于進(jìn)一步研究AOPP的病理生物學(xué)作用和干預(yù)。

本研究首次報(bào)道用特異性針對(duì)蛋白質(zhì)氧化基團(tuán)的多克隆抗體,通過免疫組化染色,清楚顯示了在實(shí)驗(yàn)性CK D和CK D患者腎組織中AOPP的沉積及其分布。初步觀察結(jié)果顯示,AOPP沉積似乎只發(fā)生于某些特定的CK D,它與CK D發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系是值得進(jìn)一步研究的問題。

綜上,我們制備了一種高效價(jià)、特異性針對(duì)白蛋白氧化修飾基因的多克隆抗體,采用這種抗體,我們首次觀察了AOPP在實(shí)驗(yàn)性CK D和CK D患者腎組織的分布,為進(jìn)一步研究AOPP的致腎病機(jī)制和臨床病理診斷提供了新工具。

致謝:感謝南方醫(yī)院腎內(nèi)科周展眉老師、汪永平博士對(duì)免疫組化實(shí)驗(yàn)提供的幫助。

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[收稿2009-10-20 修回2009-11-20]

(編輯 倪 鵬)

Preparation and application of antibodies against advanced oxidation protein products

LU Xiao,TIAN Jian-Wei,LIU Bei-Yi,HOU Xiao-Rui,ZHU Ping,HOU Fan-Fan,FU Ning.Department of Immunology,Southern Medical University,Guangzhou510515,China

Objective:T o prepare the polyclonal antibodies against advanced oxidation protein products(AOPP),and to provide an effective agent for research on the pathogenesis of AOPP and assess exactly the relationship between AOPP and relative diseases.Methods: AOPP-rabbit serum albumin(AOPP-RSA)was prepared by treating RSA with hypochloric acid.The rabbit anti-AOPP-RSA polyclonal antibodies were generated and purified by affinity chromatography.The titers and the specificityof the antibodieswere measured by ELISA.The plasma AOPP and the localizationof AOPP in nephridial tissuesof some patientswith chronic kidney disease(CK D)were determined using rabbit anti-AOPP-RSA.Results:Titers of the antibodies were 10-6.Purified antibodies reacted specifically with oxidized albumin from different genus,but could not react with normal albumin and glycosylated albumin.The high level of AOPP in plasma from CK D patients was confirmed by Western blot.The antibodies could be used to immunostain AOPP deposition in different regions of kidney tissues from both CK D patients and CK D rat models.Conclusion:We successfully generate rabbit anti-AOPP polyclonal antibodies with high titers and striking specificity.The presence of plasma AOPP and localizations of AOPP in kidney tissues of CK D patients can be demonstrated using the antibodies.The development of anti-AOPP polyclonal antibodies may provide a new tool to explore the pathogensis of AOPP and assess exactly the relationship between AOPP and relative diseases.

Advanced oxidation protein products(AOPP);Polyclonal antibodies;Chronic kidney disease(CK D)

R392.33 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-484X(2010)02-0164-05

①本文受NSFC-廣東省聯(lián)合基金資助(No.U0932002)

②南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院,廣州510515

③通訊作者,E-mail:beiyi@fimmu.com

盧 曉(1977年-),男,碩士,實(shí)驗(yàn)師,主要從事天然免疫的研究。