盛偉 王慧君 馬曉靜 李文燦 陳龍 張進(jìn) 黃國(guó)英 馬端，，*

（1.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032；2.復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，復(fù)旦大學(xué)出生缺陷研究中心，上海 200032；3.復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院，復(fù)旦大學(xué)兒童發(fā)育與疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，上海 200032；4.復(fù)旦大學(xué)法醫(yī)系，上海 200032）

先天性心臟?。╟ongenital heart disease），簡(jiǎn)稱(chēng)先心病，是指胚胎發(fā)育過(guò)程中心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生異常的一類(lèi)疾病。近年來(lái)出生缺陷調(diào)查資料顯示，先心病已躍居我國(guó)出生缺陷畸形首位，發(fā)病率占活產(chǎn)新生兒的6‰～10‰［1］。圓錐動(dòng)脈干畸形（congenital heart conotruncal defects，CTD）是先心病中最為嚴(yán)重的一種類(lèi)型，約占先心病的30%［2］。CTD是指在遺傳和環(huán)境因素的共同作用下，胚胎發(fā)育早期心臟流出道和大動(dòng)脈發(fā)育異常，臨床上表現(xiàn)為法洛四聯(lián)癥、肺動(dòng)脈閉鎖、大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位、右室雙出口、永存動(dòng)脈干等多種復(fù)雜心血管畸形，常出現(xiàn)紫紺和低氧血癥，是造成我國(guó)嬰兒和新生兒死亡最主要的原因之一。

心臟特異性轉(zhuǎn)錄因子NKX2-5高度保守，是脊椎動(dòng)物心臟育生中較早表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，是心臟前體細(xì)胞最早的標(biāo)志物，參與心臟發(fā)育的整個(gè)過(guò)程。NKX2-5自胚胎發(fā)育第7.5天開(kāi)始持續(xù)表達(dá)，其正常表達(dá)對(duì)心臟的環(huán)化、心房及心室發(fā)育、動(dòng)脈干分隔、房室瓣形成及房室傳導(dǎo)的維持均起重要作用［3］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，NKX2-5參與了胚胎心臟發(fā)育，是引起心臟畸形的關(guān)鍵因素，敲除NKX2-5基因的小鼠胚胎在10.5天由于心臟缺失而死亡［4］。臨床研究顯示，NKX2-5基因在患兒人群中發(fā)生突變的比例非常低，如法洛四聯(lián)癥和房間隔缺損患者中僅有4%發(fā)生突變［5］。最近也有學(xué)者提出，基因序列的改變不是NKX2-5引起心臟畸形的主要原因［6］。

除了編碼序列改變可以導(dǎo)致基因的功能異常以外，基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化變化也可以影響基因的表達(dá)，從而使所編碼的蛋白出現(xiàn)量的差異。本研究擬通過(guò)比較該基因在正常心臟組織與CTD病變組織中的甲基化狀態(tài)的差異，了解NKX2-5基因的甲基化狀態(tài)與CTD的關(guān)系，為先心病的早期基因診斷提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 Tru1l限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自Fermentas公司，IPTG購(gòu)自Promega公司，蛋白酶抑制劑購(gòu)自Sigma公司，Glutathione Sepharose 4B購(gòu)自GE Healt hcare公司，組織基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司，PCR產(chǎn)物回收試劑盒購(gòu)自QIAGRN公司，LA Taq聚合酶、T4 DNA連接酶和實(shí)時(shí)定量PCR試劑均購(gòu)自Ta KaRa公司，所有引物均在上海桑尼生物公司合成。含有PET4-GST-MBD重組質(zhì)粒的大腸桿菌為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 研究材料 正常兒童心臟組織取自復(fù)旦大學(xué)法醫(yī)學(xué)系。圓錐動(dòng)脈干畸形病變組織由復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院提供。本研究涉及的人體組織樣本均經(jīng)所有研究對(duì)象簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 NKX2-5基因啟動(dòng)子區(qū)Cp G島預(yù)測(cè)及Real Time PCR引物設(shè)計(jì) 登陸http：／／genome.ucsc.edu／網(wǎng)站，查找人的NKX2-5基因啟動(dòng)子區(qū)，通過(guò)甲基化分析軟件（Methyl Primer Express v 1.0）確定啟動(dòng)子區(qū)的Cp G島位置，根據(jù)Tru1l限制性?xún)?nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，確定Real Time PCR的擴(kuò)增區(qū)域，然后利用引物設(shè)計(jì)軟件（primer premier 5）設(shè)計(jì)Real Time PCR引物。

1.2.2 基因組片段化與接頭連接 組織樣品基因組DNA按照QIAGEN公司的組織基因組DNA提取試劑盒步驟進(jìn)行提取。取正常心臟組織和CTD病變組織基因組各1μg，利用Tru1l限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切，反應(yīng)體系為：各基因組1μg，Tru1l酶1μL，10×buffer 2.5μL，補(bǔ)加滅菌蒸餾水至終體積為25μL，再加入10μL石蠟油防止蒸發(fā)，反應(yīng)條件為65℃3～4小時(shí)，利用酶切回收試劑盒對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收。接頭引物序列為：H-24，5-AGG CAA CTG TGC TAT CCG AGG GAT，H-12，5-TAA TCC CTC GGA。各取200μM的接頭引物100μL，94℃5分鐘，然后將2種引物匯合，自然冷卻形成接頭。利用T4 DNA連接酶，將基因組DNA酶切回收產(chǎn)物與制備的接頭進(jìn)行連接，反應(yīng)體系為：10×T4 buffer 5μL，酶切回收產(chǎn)物 10μL，接頭 2μL，PEG4000 4μL，T4連接酶2μL，補(bǔ)加滅菌蒸餾水至終體積為50μL，反應(yīng)條件為16℃，過(guò)夜。

1.2.3 GST／MBD融合蛋白的表達(dá)純化及活性檢測(cè)將含有PET4-GST-MBD重組質(zhì)粒的大腸桿菌在LB-Kan平板上進(jìn)行劃板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜；挑取單克隆，接種于10ml LB-kan液體培養(yǎng)基中；次日將培養(yǎng)液接種于200ml LB-kan液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；用終濃度為1m M的IPTG誘導(dǎo)3～4小時(shí)以表達(dá)GST／MBD融合蛋白，分別在1.5小時(shí)（誘導(dǎo)前）、4小時(shí)（誘導(dǎo)后）取待檢測(cè)樣品，通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果。200ml誘導(dǎo)后菌液離心后懸浮在PBS-T（1%Triton X-100）緩沖液中，此緩沖液中含有終濃度為1m M的PMSF和50mg／ml的溶菌酶，冰上放置30分鐘，超聲破碎細(xì)胞，溶解產(chǎn)物經(jīng)高速離心，上清過(guò)Glutathione Sepharose 4B層析柱，并用10倍柱體積的PBS洗去非特異性結(jié)合的蛋白，用低鹽濃度結(jié)合緩沖液洗去大腸桿菌DNA，最后獲得純化的GST／MBD蛋白［7］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究已證實(shí)，采用不同的鹽離子強(qiáng)度的緩沖液進(jìn)行洗脫，可以把甲基化的DNA和非甲基化的DNA分開(kāi)，實(shí)驗(yàn)條件為：100m M NaCl緩沖液為結(jié)合緩沖液，500m M NaCl緩沖液為洗滌緩沖液，1 000m M NaCl的緩沖液為洗脫緩沖液［8］。

1.2.4 基因組中甲基化DNA富集 取GST／MBD蛋白層析柱100μL，離心去上清，用100μL 500m M NaCl的洗滌緩沖液平衡2次，在含有100m M NaCl的結(jié)合緩沖液中結(jié)合基因組DNA，放在搖床上4℃結(jié)合1小時(shí)。用500m M NaCl的緩沖液洗滌，以去除非甲基化DNA，最后用1 000m M NaCl的洗脫緩沖液洗脫并回收甲基化DNA。

1.2.5 LM-PCR擴(kuò)增富集甲基化DNA 由于富集下來(lái)的甲基化DNA量較少，不能滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求，因此需要對(duì)富集的甲基化DNA進(jìn)行有效的擴(kuò)增。以富集的甲基化DNA為模板，H24為引物進(jìn)行2輪LM-PCR擴(kuò)增，從而獲得足夠量的富集甲基化DNA的PCR產(chǎn)物，用PCR產(chǎn)物回收試劑盒進(jìn)行純化回收，-20℃儲(chǔ)存以備后續(xù)研究。

1.2.6 Real Time PCR檢測(cè)樣本中NKX2-5基因的甲基化狀態(tài) 采用SYBR Green Real Time檢測(cè)樣本NKX2-5基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)中選取6例先天性圓錐動(dòng)脈干畸形組織樣本和1例正常心臟組織樣本作為研究對(duì)象，各取100ng富集甲基化DNA LM-PCR產(chǎn)物為模板，以DXZ4為內(nèi)參，利用比較定量法，根據(jù)Ct值與起始模板拷貝數(shù)呈線(xiàn)性關(guān)系，分析不同樣本中Ct值的變化，每個(gè)樣本重復(fù)3次，取其平均值。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 NKX2-5基因啟動(dòng)子區(qū)Cp G島的預(yù)測(cè)及Real Time PCR擴(kuò)增區(qū)域的確定 利用http：／／genome.ucsc.edu／網(wǎng)站及甲基化分析軟件（Methyl Primer Express v1.0）確定NKX2-5基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游5kb內(nèi)有3個(gè)Cp G島（圖1），根據(jù)Tru1l酶切片段的大小以及啟動(dòng)子區(qū)的確定，本研究選取了Cp G島2中的1段，利用引物設(shè)計(jì)軟件（primer premier 5）設(shè)計(jì)Real Time PCR引物，其上游引物為：GGCTTTGATGAGGGACAGGA，下游引物為CAAGGTGCGGAGGAAACG，產(chǎn)物長(zhǎng)度為162bp。

圖1 NKX2-5基因啟動(dòng)子區(qū)Cp G島分布

2.2 基因組DNA片段化與接頭連接分析 Tru1l酶切位點(diǎn)是TTAA，對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切時(shí)可以保留絕大部分Cp G點(diǎn)的完整性，同時(shí)片段化基因組的大小集中在300～700之間（圖2A），符合實(shí)驗(yàn)的預(yù)期目標(biāo)。接頭連接的成功與否直接關(guān)系到后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成敗。以連接產(chǎn)物為模板，H24為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳分析表明接頭連接成功（圖2B）。

2.3 GST／MBD融合蛋白的表達(dá)純化 含有PET4-GST-MBD重組質(zhì)粒的大腸桿菌，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)GST／MBD融合蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明，在菌液的上清中有大量的融合蛋白表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白經(jīng)過(guò)Glutathione Sepharose 4B柱純化，可以得到純度較高的蛋白，其分子量大小與預(yù)期大小一致（圖3）。

2.4 Real Time PCR檢測(cè)結(jié)果分析 通過(guò)Real Time PCR檢測(cè)，與正常心臟組織相比，不同CTD病變組織中NKX2-5基因的Ct值發(fā)生不同程度的改變（表1），其值變化范圍在15～35之間，屬于正常分析范圍；根據(jù)其擴(kuò)增曲線(xiàn)（圖4）以及RQ柱狀圖分析（圖5），樣本T8、T11、T27和T76呈現(xiàn)高甲基化，分別是正常心臟組織樣本的3.5、4.2、2.1和2.4倍，T6和T19則無(wú)明顯變化。

圖3 GST／MBD融合蛋白的表達(dá)和純化

表1 正常心臟組織和不同病變組織樣本中NKX 2-5基因Real Time PCR Ct值

圖4 NKX2-5基因啟動(dòng)子甲基化Real Time PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)圖

圖5 NKX2-5基因啟動(dòng)子甲基化Real Time PCR RQ檢測(cè)結(jié)果

3 討論

人NKX2-5基因定位于染色體5q35，含2個(gè)外顯子，編碼324個(gè)氨基酸。NKX2-5基因位于眾多對(duì)心臟發(fā)育有重要作用基因的上游，如TFGBR3、EDG7、BMP10、CX43、NPPA，以及最近發(fā)現(xiàn)的Etsrp71和Chibby等。應(yīng)用原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)在NKX2-5基因純合敲除小鼠中，Anp、MeCP2C、Carp等基因表達(dá)受到嚴(yán)重干擾［9］。同時(shí)，NKX2-5基因也受 Nodal、Shh／Ihh、Wnt、Notch和BMP2等多個(gè)早期胚胎發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路調(diào)節(jié)［10］。

NKX2-5基因啟動(dòng)子區(qū)存在多個(gè)具有重要功能的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子，以及抑制因子和自動(dòng)調(diào)節(jié)因子的結(jié)合元件。這些元件在與相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后，在不同的時(shí)間和空間調(diào)控NKX2-5基因的表達(dá)。本研究利用甲基化結(jié)合蛋白（MBD）能夠與甲基化DNA特異性結(jié)合的特性，將酶切后片段化的基因組甲基化DNA進(jìn)行有效地富集，同時(shí)根據(jù)Real Time PCR中Ct值與起始模板拷貝數(shù)呈線(xiàn)性關(guān)系這種理論，利用SYBR Green Real Time PCR檢測(cè)CTD樣本和正常心臟樣本中NKX2-5基因啟動(dòng)子區(qū)Cp G島的甲基化狀態(tài)。結(jié)果表明，該方法靈敏度高，準(zhǔn)確性強(qiáng)，能夠有效地檢測(cè)出不同樣本之間的甲基化狀態(tài)。在所測(cè)的6例CTD組織樣本中，與正常組織樣本相比，4例呈現(xiàn)高甲基化，2例甲基化狀態(tài)改變不明顯。由此推斷，NKX2-5基因表達(dá)異?？赡芘c該基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化有關(guān)。今后我們將擴(kuò)大樣本檢測(cè)量，以進(jìn)一步證實(shí)這個(gè)重要的現(xiàn)象。

總之，在本研究中，通過(guò)Real Time PCR檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)在CTD病變組織中NKX2-5基因啟動(dòng)子區(qū)Cp G島發(fā)生了不同程度的甲基化，表明該基因啟動(dòng)子區(qū)Cp G島甲基化可能與先心病的發(fā)生有關(guān)。同時(shí)，這種變化有可能對(duì)先心病的早期基因診斷有價(jià)值，值得進(jìn)一步探索。

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