曾紹東，歐仕益，吳建中

（暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州510632）

酶法水解羅非魚蛋白及產(chǎn)物脫腥

曾紹東，歐仕益，吳建中*

（暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州510632）

采用Alcalase蛋白酶酶解羅非魚蛋白，優(yōu)化水解的各項(xiàng)參數(shù)。利用D113型陽離子交換樹脂脫除酶解液腥味。結(jié)果表明：羅非魚肉經(jīng)冷凍處理有利于提高水解度（DH），Alcalase最佳酶解條件為pH8.0，溫度60.0℃、每克底物蛋白中酶加量為3000 U，液料比3∶1(g/g)、酶解時(shí)間3.0 h，在此條件下水解度為18.23%。酶解液經(jīng)D113樹脂處理后，腥味顯著降低，溶液顏色透明澄清，略帶金黃色，感官品質(zhì)有所改善。

羅非魚；酶解；陽離子交換樹脂；脫腥

Abstract:Alcalase was used to hydrolysis tilapia protein and the hydrolysis parameters were optimized.D113 cation exchange resin was used to deodorization.Results showed that freezing pretreatment increase the degree of hydrolysis（DH）and a maximum DH of 18.23%was obtained by hydrolysis for 3.0 h using alcalase at 60.0 ℃,pH8.0,enzyme dosage 3000 U/g（basis of substrate protein）,and liquid/solid ratio 3∶1(g/g).A clarified product with low fishiness,light golden color was obtained after treated with D113 resin.

Key words：tilapia;enzymatic hydrolysis;cation exchange resin;deodorization

魚蛋白經(jīng)酶解制備的低聚肽據(jù)報(bào)道有多種功能性[1-2]，可以開發(fā)成相應(yīng)保健食品，具有較大的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值。使用蛋白酶水解羅非魚蛋白制備低聚肽可以提高羅非魚的加工水平，擴(kuò)寬產(chǎn)品應(yīng)用范圍，產(chǎn)生較好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但由于存在于魚皮黏液及魚血液中的δ-氨基戊酸、δ-氨基戊醛和六氫吡啶類化合物等共同作用形成魚腥味，且在儲(chǔ)藏和加工過程中氧化三甲胺降解為三甲胺、二甲胺等物質(zhì)，使得腥味增加[3]，通過酶解制得的酶解液腥味重，感官品質(zhì)差，不易于被人們所接受，所以在利用魚蛋白制備活性肽時(shí)酶解液的脫腥是一個(gè)關(guān)鍵問題。以羅非魚肉為原料，優(yōu)化Alcalase蛋白酶酶解條件，利用D113型陽離子交換樹脂脫除酶解液中的腥味，改善其感官品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮尼羅羅非魚：鮮活，大小均一，體重為250 g～400 g，購(gòu)于暨南大學(xué)菜市場(chǎng)；D113型陽離子交換樹脂：天津南開大學(xué)化工廠；Alcalase2.4L堿性蛋白酶：諾維信公司；考馬斯亮藍(lán)G-250：北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司，分析純；牛血清白蛋白：上海伯奧生物科技有限公司，層析純；氫氧化鈉、鹽酸、磷酸等均為分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器

SHA-B型恒溫振蕩器：江蘇金壇宏華儀器公司；UV-9600紫外可見分光光度計(jì)：北京瑞利分析儀器公司；臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；恒溫水浴鍋：江蘇金壇市宏華儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 D113樹脂的預(yù)處理

首先用乙醇浸泡24 h，使之充分溶脹，然后用去離子水將醇洗凈，其后用2倍體積的1 mol/L的NaOH溶液浸泡4 h，用去離子水沖洗樹脂直至排出水接近中性為止，最后用2倍體積1 mol/L HCl溶液浸泡4 h，用去離子水洗至中性即可[4]，使用前抽濾脫水備用。

1.3.2 羅非魚肉的制取

將購(gòu)買的鮮活羅非魚，迅速運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，去內(nèi)臟和魚鱗，清洗，取魚肉，瀝干，絞碎備用。

1.3.3 預(yù)處理對(duì)水解度的影響

取新鮮羅非魚肉，分別在-18℃冰箱中冷凍處理一周以及在80、100℃下分別加熱處理5、30 min，加酶酶解3 h，測(cè)定水解度并確定最佳預(yù)處理工藝。

1.3.4 Alcalase酶解條件的優(yōu)化

取冷凍羅非魚肉（蛋白質(zhì)含量為18.6%）室溫解凍，按一定的比例（g/g）加水勻漿。放入恒溫水浴鍋中，保溫至所需溫度，調(diào)至試驗(yàn)所需pH值，按設(shè)定量加入Alcalase開始酶解，酶解過程中滴加1.0 mol/L NaOH保持pH值恒定，每隔一定時(shí)間記錄消耗NaOH的體積數(shù)測(cè)定水解度，優(yōu)化酶解的條件。

1.3.5 酶解液樹脂脫腥

按照酶解的最優(yōu)條件加酶酶解羅非魚肉，酶解完成后沸水浴10 min滅酶活，4000 r/min離心15 min，取上清液即為酶解原液。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)的結(jié)果，酶解原液采用D113型樹脂脫腥：取適量體積酶解液原液置于具塞錐形瓶中，調(diào)pH值至5.0，加入酶解液體積5.0%重量的D113型樹脂，室溫下以150 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩吸附1 h，分離樹脂即得脫腥酶解液。

1.3.6 分析測(cè)定方法

1.3.6.1 酶活力的測(cè)定

參照GB/T 23527-2009《蛋白酶制劑》，福林法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6.2 DH的計(jì)算[5]

式中：h為被裂解的肽鍵數(shù)；B為耗堿量，mL；Nb為堿的摩爾濃度，(mol/L)；α為α-氨基的平均離解度；MP為蛋白質(zhì)質(zhì)量，g；htot為蛋白質(zhì)底物的總肽鍵數(shù)。

1.3.6.3 蛋白質(zhì)（肽）含量的測(cè)定[6]

考馬斯亮藍(lán)法原理是通過范德華力將染料分子與蛋白質(zhì)或肽分子結(jié)合，形成在595 nm下有最大吸收的結(jié)合物[7]，從而可以對(duì)蛋白質(zhì)和肽進(jìn)行測(cè)定，具體方法是：取酶解液0.5 mL，加去離子水 0.5 mL，加入5.0 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，靜置5 min后比色測(cè)定溶液在595 nm下的吸光值A(chǔ)，按照牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)曲線線性回歸方程y=203.3x-1.0016（R2=0.9992），x為595 nm下吸光值，y為蛋白質(zhì)含量（μg），將吸光值A(chǔ)595 nm轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)（肽）含量。

1.3.6.4 腥味感官評(píng)價(jià)[8-9]

評(píng)定過程是由8名(4男4女)經(jīng)過訓(xùn)練的感官評(píng)價(jià)員在食品感官實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，評(píng)定室溫為25℃左右。按照感官評(píng)定的規(guī)范要求，每次的樣品數(shù)最多不超過5個(gè)，評(píng)定過程中不得相互交流，每評(píng)定完一個(gè)樣品后，間隔幾分鐘再評(píng)定下一個(gè)樣品，以蒸餾水作為參照（分值為0），根據(jù)表1的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分值就是腥味值，得出的平均值表示水解液的腥味程度。

表1 脫腥效果的腥味評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Standards of grading for fishiness evaluation

2 結(jié)果與分析

2.1 羅非魚肉預(yù)處理方法對(duì)DH的影響

對(duì)羅非魚肉原料進(jìn)行不同方法預(yù)處理，加酶酶解并測(cè)定DH，預(yù)處理方法對(duì)DH的影響見圖1。

圖1 不同預(yù)處理方法對(duì)DH的影響Fig.1 Effect of pretreatment on degree of hydrolysis of tilapia protein

由圖1可以看出，不同預(yù)處理方法對(duì)酶解水解度的影響不同，經(jīng)過加熱預(yù)處理的樣品水解程度明顯低于新鮮和冷凍處理的樣品，加熱處理的各樣品隨著加熱溫度和時(shí)間的不同，蛋白質(zhì)的水解程度也不同。其中冷凍處理后魚肉的水解度最高，分析其中原因肯能是①未經(jīng)加熱處理的羅非魚肉保留了天然的內(nèi)源蛋白酶，酶解過程中內(nèi)源蛋白酶與外加蛋白酶具有協(xié)同作用。②冷凍過程造成魚肉細(xì)胞的破裂，促進(jìn)內(nèi)源蛋白酶的溶出，進(jìn)一步提高了水解度。此外新鮮魚肉的水解度也高于加熱處理后的羅非魚肉，其原因可能同樣是因?yàn)樘烊坏膬?nèi)源蛋白酶存在。

2.2 Alcalase酶解條件的確定

2.2.1 pH值對(duì)水解度的影響

固定其它指標(biāo)，考察pH值對(duì)DH的影響效果，結(jié)果見圖2。

pH值直接影響到酶和底物蛋白分子的某些解離基團(tuán)的解離狀態(tài)，從而影響到酶和底物的結(jié)合或催化，使蛋白酶的水解效果受到影響[10]。從圖2可以看出，在試驗(yàn)選取的pH值范圍內(nèi)，隨著pH值的增大蛋白質(zhì)的水解度先升后降，在pH為8.0時(shí)水解度達(dá)到最高，所以選擇最適pH值為8.0。

2.2.2 溫度對(duì)水解度的影響

固定其它指標(biāo)，考察酶解溫度值對(duì)DH的影響效果，結(jié)果見圖3。

圖2 pH值對(duì)水解度的影響Fig.2 Effect of pH value on degree of hydrolysis of tilapia protein

圖3 溫度對(duì)水解度的影響Fig.3 Effect of temperature on degree of hydrolysis of tilapia protein

溫度對(duì)酶促反應(yīng)速率的影響表現(xiàn)在兩個(gè)方面，一方面是當(dāng)溫度升高時(shí)，反應(yīng)速率加快。另一方面由于酶是蛋白質(zhì)，隨著溫度的升高，使酶逐漸變性而失活，引起酶反應(yīng)速率的下降，所以溫度過高或者過低都會(huì)影響反應(yīng)速率[10]。從圖3可以看出，在試驗(yàn)選取的溫度范圍內(nèi)，蛋白酶的酶解效果隨著溫度的上升呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在60.0℃時(shí)水解度最高，所以選擇最佳溫度為60.0℃。

2.2.3 酶添加量對(duì)水解的影響

固定其它指標(biāo)，考察蛋白酶添加量對(duì)DH的影響，結(jié)果見圖4。

從圖4可以看出，隨著酶加量的增加，羅非魚蛋白的水解程度增加。當(dāng)每克底物蛋白中酶加量超過3000 U時(shí)，水解度的增加趨勢(shì)變緩慢。在制備蛋白水解液時(shí)酶的用量要控制得當(dāng)，酶加量太低，水解度達(dá)不到較好的水平；酶加量太高，則會(huì)增加蛋白酶的成本投入。因此，綜合考慮，選取每克底物蛋白中酶添加量為3000 U。

圖4 酶加量對(duì)水解度的影響Fig.4 Effect of enzyme dose on degree of hydrolysis of tilapia protein

2.2.4 料液比對(duì)水解度的影響

固定其它指標(biāo)，考察料液比對(duì)DH的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 液料比對(duì)水解度的影響Fig.5 Effect of liquid/solid ratio on degree of hydrolysis of tilapia protein

液料比的大小會(huì)影響到酶與底物的結(jié)合，從而影響蛋白酶的水解效果。液料比過低，液料的黏度也相對(duì)較大，阻礙了酶和底物充分接觸，反應(yīng)不易進(jìn)行。液料比過高，底物與酶的接觸機(jī)會(huì)減少，導(dǎo)致反應(yīng)速度降低，從而酶解液的水解度降低。從圖5可以看出，隨著液料比的增加，水解度逐漸上升，當(dāng)液料比大于3∶1時(shí)，水解度的變化不明顯。在實(shí)際生產(chǎn)中，液料比太大會(huì)增加濃縮成本，考慮到各方面因素，液料比選擇在3∶1 最合適。

2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響

在酶解條件為pH8.0，溫度60.0℃、酶加量每克底物蛋白為 3000 U、液料比為 3∶1(g/g)，加入 Alcalase酶解經(jīng)冷凍處理的羅非魚肉，酶解時(shí)間對(duì)DH的影響見圖6。從圖6可以看出，羅非魚酶解過程符合典型水解曲線。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)水解度增大，在5h的酶解過程中，蛋白質(zhì)水解度的增加主要集中在反應(yīng)前2 h，3 h以后水解度變化趨于平緩，增加酶解時(shí)間已不能提高水解度，且為了防止酶解時(shí)間過長(zhǎng)而導(dǎo)致酶解液產(chǎn)生異味，Alcalase酶解反應(yīng)的合適時(shí)間定為3.0 h，在此條件下酶解液的水解度為18.23%。

圖6 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.6 Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis of tilapia protein

2.3 D113型樹脂脫腥

表2 樹脂處理前后酶解液的感官和理化特性Table 2 The sensory and chemi-physical properties of hydrolysate before and after resin treatment

從表2可以看出，羅非魚酶解液經(jīng)D113陽離子交換樹脂處理后腥味有顯著的下降。酶解液原液腥味很重，呈深黃褐色，感官品質(zhì)差，讓人難以接受。經(jīng)過D113型樹脂處理后腥味分值下降到1.4，略帶金黃色，溶液澄清透明，感官品質(zhì)有所改善。這可能是在呈酸性條件下，酶解液中的二甲胺、三甲胺等腥味物質(zhì)更多地以陽離子的形式存在，與D113陽離子樹脂上的基團(tuán)發(fā)生了交換吸附，從而達(dá)到脫腥的效果。

3 結(jié)論

1)羅非魚肉經(jīng)冷凍預(yù)處理可以適當(dāng)提高酶解水解度。

2)Alcalase蛋白酶酶解羅非魚肉的最佳條件為：pH8.0，溫度60.0℃、酶添加量為每克底物蛋白3000 U，液料比3∶1(g/g)、酶解時(shí)間3.0 h，在此條件下制得的酶解液水解度為18.23%。

3)羅非魚酶解液經(jīng)D113型陽離子交換樹脂處理后腥味分值為1.4，與原液相比腥味顯著降低，處理后的酶解液澄清透明，略帶金黃色，感官品質(zhì)有所改善。

[1]Dabrowski K，Zhang Y F,Kwasek K,et al.Effects of protein-,peptide-and free amino acid-based diets in fish nutrition[J].Aquaculture Research,2010,41(5)：668-683

[2]Candido L M B,Sgarbieri V C.Enzymatic hydrolysis of Nile tilapia(Oreochromus niloticus)myofibrillar proteins：effects on nutritional and hydrophilic properties[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,2003,83(9)：937-944

[3]夏延斌.食品風(fēng)味化學(xué)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2008：177-187

[4]鄭輝杰，李志強(qiáng)，何姍.離子交換法提取發(fā)酵液中乳酸的工藝研究[J].食品科學(xué)，2009，30(6)：84-88

[5]Adler-Nissen Jens.Enzymic hydrolysis of food proteins[M].London：Elsevier Applied science Publishers,1986：132-152

[6]付英杰,田景振.阿膠低肽酶解工藝的實(shí)驗(yàn)研究[J].中成藥，2010，32(1)：143-146

[7]陸健.蛋白質(zhì)純化技術(shù)及應(yīng)用[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：173

[8]張水華，徐樹來，王永華.食品感官分析與實(shí)驗(yàn)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006：30-32

[9]楊文鴿，張芝芬，黃曉春，等.三角帆蚌肉酶解液的脫苦脫腥研究[J].食品科學(xué)，2003，24(4)：94-97

[10]王鏡巖，朱圣庚，徐長(zhǎng)法.生物化學(xué)：上冊(cè)[M].北京：高等教育出版社，2002：378-380

Research of Enzymatic Hydrolysis of Tilapia Protein and Deodorization of Hydrolysates

ZENG Shao-dong,OU Shi-yi,WU Jian-zhong*
（Department of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632，Guangdong,China）

2010-05-17

廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研專項(xiàng)項(xiàng)目（2009B090200012）；粵港關(guān)鍵領(lǐng)域重點(diǎn)突破項(xiàng)目（2009Z026）；佛山市禪城區(qū)項(xiàng)目（2008B1043）

曾紹東（1983—），男(漢)，碩士研究生，主要從事功能性食品研究。

*通信作者：吳建中，男，副教授。