陳曉偉，陳榮燕，韋媛媛，廖蘭，覃燕玲

（廣西工學院生物與化學工程系，廣西柳州545006）

超聲波輔助堿水提枳實中橙皮苷的研究

陳曉偉，陳榮燕，韋媛媛，廖蘭，覃燕玲

（廣西工學院生物與化學工程系，廣西柳州545006）

采用單因素和正交試驗設計探討超聲輔助提取枳實中橙皮苷的最佳工藝。枳實樣品堿化后用乙醇超聲輔助提取，用分光光度法測定橙皮苷含量。最優(yōu)提取條件為：4倍量65%乙醇-NaOH溶液（pH為13），50℃超聲提取3次每次50 min，加HCl調(diào)節(jié)pH至7，靜置析晶10 h，3批枳實樣品橙皮苷平均含量為32.3 mg/g。超聲輔助堿水提取枳實中橙皮苷的方法簡便可行。

枳實；橙皮苷；超聲波輔助提?。徽辉囼?；含量測定

Abstract:To study on the ultrasonic-associated alkali extraction of hesperidin from Citrus aurantium by singlefactor and orthogonal test.Hesperidin was extracted with ethanol-NaOH and determined by UV-visiblespectrophotometry.The optimal ultrasound-associated extraction conditions were 4 times the mass of 65%ethanol-NaOH (pH=13)at 50℃for 50 minitus and extracting 3 times,the extract was precipitated for 10 hours at pH=7.The content of hesperidin was 32.3 mg/g.The optimal extraction technology was stable and feasible.

Key words：citrus aurantium;hesperidin;ultrasonic-associated extraction;orthogonal test;content determination

枳實為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培變種或甜橙Citrus sinensis Osbeck的干燥幼果。枳實具有破氣消積，化痰散痞等功效[1]可入藥使用，早在中藥典籍《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載。枳實中主要含有黃酮、生物堿及揮發(fā)油等成分。橙皮苷屬雙氫黃酮糖苷類化合物，具有抗氧化、抑菌、消炎等作用[2]，可作為藥品和食品保鮮劑應用。傳統(tǒng)工藝大多采用Ca(OH)2堿提酸沉法直接提取枳實中橙皮苷，近年來有文獻報道[3]以有機溶劑輔助堿提酸析提取橙皮苷，提高了提取率，而超聲波具有強大的“空化效應”能加速橙皮苷的大量浸出[4]，因而本研究結(jié)合超聲波法和有機溶劑輔助堿水提取枳實中橙皮苷，通過實驗尋找出最佳條件。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

220V 50HZ超聲波清洗儀：必能信超聲有限公司；ZX-98型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：鞏義市英峪予華儀器廠；UV2100型紫外可見分光光度計：尤尼科儀器有限公司。

1.2 材料與試劑

枳實藥材：購于柳州老百姓大藥房；橙皮苷對照品：科翔生物科技有限公司；乙醇、甲醇、NaOH、HCl等均為市售分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 工藝流程

枳實粉末50 g→加入pH=13的乙醇-NaOH溶液200 mL→超聲波提取→減壓抽濾→濾液用HCl調(diào)節(jié)pH值→靜置結(jié)晶→減壓抽慮→洗滌提取物至洗滌液無色→70℃恒溫烘干→稱重→得到提取物

2.2 樣品中橙皮苷含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取橙皮苷對照品4.0 mg置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻，即得濃度為0.080 mg/mL橙皮苷對照品貯備液。

2.2.2 樣品溶液的制備

準確稱取干燥提取物1.0mg，用甲醇定容至10mL，即為樣品溶液。

2.2.3 檢測波長的選擇

分別取橙皮苷對照品液、樣品液適量、溶劑甲醇、乙醇，以空白溶液作參比，用紫外掃描儀，于200 nm～400 nm范圍，掃描其最大吸收峰。結(jié)果表明，對照品和樣品溶液在284 nm處有最大吸收，同時溶劑在此波長下無干擾，故選擇284 nm作為檢測波長。

2.2.4 標準曲線制備

精密量取橙皮苷對照品溶液 0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL于10 mL的容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，以第1管作空白對照，在284 nm處測吸光度。以橙皮苷對照品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。結(jié)果表明，橙皮苷在0.008 mg/mL～0.080 mg/mL范圍內(nèi)濃度與吸光度呈良好線性關(guān)系，得到回歸曲線方程為：Y=18.055X+0.0129，r=0.9990（n=6）。

2.3 枳實提取單因素試驗

2.3.1 料液比對提取橙皮苷的影響

稱取枳實 50.0 g，加入料液比分別為 1∶2、1∶3、1∶4、1∶6（mL/g）的 pH=13、65%乙醇-NaOH 溶液，加熱至 30℃，超聲30 min，減壓抽濾除去濾渣，濾液用HCl調(diào)節(jié)pH=7，靜置5 h，減壓抽濾，洗滌沉淀，烘干，按2.2.2法制備樣品溶液，并測定橙皮苷含量。結(jié)果見圖1，料液比為1∶4（mL/g）時，橙皮苷的提取率達到高峰。

圖1 提取液用量對橙皮苷含量的影響Fig.1 Effects of different amounts of extract fluid on the content of hesperidin

2.3.2 超聲時間對提取橙皮苷的影響

稱取枳實 50.0 g，加入料液比為 1∶4（mL/g）的pH=13、65%乙醇-NaOH溶液，提取時控制溫度為30℃，超聲提取 10、20、30、40、50、60 min，減壓抽濾除去濾渣，濾液用HCl調(diào)節(jié)pH=7，靜置5 h，減壓抽濾，洗滌沉淀，烘干，并測定橙皮苷含量。結(jié)果見圖2。

圖2 超聲時間對橙皮苷含量的影響Fig.2 Effects of the extraction time on the content of hesperidin

在50 min以后橙皮甙含量有明顯的下降趨勢。其原因可能是長時間的超聲波空化作用對于橙皮甙結(jié)構(gòu)有一定的破壞，使橙皮甙的產(chǎn)量有所下降。故應選擇在30 min～50 min內(nèi)最好。

2.3.3 超聲溫度對提取橙皮苷的影響

稱取枳實50.0 g，加入料液比為1∶4的pH=13、65%乙醇-NaOH溶液，分別控制溫度30、40、50、60℃下進行提取30 min，減壓抽濾除去濾渣，濾液用HCl調(diào)節(jié)pH=7，靜置5 h，減壓抽濾，洗滌沉淀，烘干，并測定橙皮苷含量。結(jié)果見圖3，隨著溫度升高橙皮甙含量會逐漸增加，50℃時溶液浸提效果最好，溫度繼續(xù)升高時，浸提效率將降低。且實驗過程中出現(xiàn)溫度高于60℃后成品顏色發(fā)黑，溶出的非橙皮甙成分增加。

圖3 溫度對橙皮苷含量的影響Fig.3 Effect of the extraction temperature on the content of hesperidin

2.3.4 超聲次數(shù)對提取橙皮苷的影響

稱取枳實50.0 g，加入料液比為1∶4的pH=13、65%乙醇-NaOH 溶液，溫度 30℃提取 1、2、3、4次，每次30 min，減壓抽濾除去濾渣，濾液用HCl調(diào)節(jié)pH=7,靜置5 h，減壓抽濾，洗滌沉淀，烘干，并測定橙皮苷含量，結(jié)果表明，表明超聲次數(shù)從1～3次橙皮甙含量越來越高，但提取到第4次時橙皮甙含量略有下降，因此超聲次數(shù)選擇在3次以內(nèi)，可以節(jié)省時間和資源又可以提高產(chǎn)率，見圖4。

圖4 提取次數(shù)對橙皮苷含量的影響Fig.4 Effects of the numbers of extraction on the content of hesperidin

2.3.5 酸沉pH值的選擇

稱取枳實50.0 g，加入料液比為1∶4的pH=13、65%乙醇-NaOH溶液，溫度50℃提取3次，每次30 min，減壓抽濾除去濾渣，濾液用HCl分別調(diào)節(jié)pH=5、6、7，靜置5 h，減壓抽濾，洗滌沉淀，烘干，并測定橙皮苷含量。結(jié)果表明pH=7時提取物中橙皮苷含量最高。

2.3.6 靜置時間的選擇

稱取枳實50.0 g，加入料液比為1∶4的pH=13、65%乙醇-NaOH溶液，溫度50℃提取3次，每次30 min，減壓抽濾除去濾渣，濾液用HCl分別調(diào)節(jié)pH=7，分別靜置 4、6、8、12、16 h，減壓抽濾，洗滌沉淀，烘干，并測定橙皮苷含量。靜置時間越長橙皮甙含量越高，但靜置10 h后提取率幾乎趨于平衡。

2.4 正交試驗

由于超聲波輔助堿水提取過程對提取率的影響較大，因此在單因素預試驗基礎(chǔ)上，選擇超聲時間（A）、料液比（B）、超聲次數(shù)（C）、超聲溫度（D）4個因素進行正交試驗考察，按照L9（34）正交表安排試驗見表1，結(jié)果見表2。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

由極差分析結(jié)果得，各因素對橙皮苷提取量的影響順序為：D（超聲溫度）＞C（超聲次數(shù)）＞A（超聲時間）＞B（料液比）。最優(yōu)組合方案為D2C3A3B1，即溫度為50℃，超聲3次每次50 min，料液比為1∶4橙皮苷提取率最高。

2.5 最優(yōu)方案驗證

按照2.4優(yōu)化條件提?。悍Q取3份枳實粉末各約50g，加入65%乙醇-NaOHpH值為13的溶液200mL，置于超聲波提取器中控制溫度為50℃，超聲3次，每次50 min，減壓抽濾，濾液用HCl溶液調(diào)節(jié)pH=7，靜置10 h，減壓抽慮，用去離子水洗滌產(chǎn)品至洗滌液無色。將提取物70℃恒溫烘干，稱重，準確稱取提取物1.0mg，用甲醇定容成10 mL，制備為樣品溶液，用紫外-可見分光光度計在284 nm處測其吸光度，并計算枳實中橙皮苷含量，結(jié)果見表3。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

表3 樣品測定結(jié)果Table 3 Determination results of samples

從表3可看出，最佳提取工藝條件具有較好重復性，橙皮苷得率較高，說明該工藝條件合理可靠。

3 結(jié)論

堿提酸沉的原理是利用橙皮甙在堿性條件下開環(huán)溶解進行提取，酸性條件下閉環(huán)沉淀進行分離。傳統(tǒng)工藝中常用生石灰，由于生石灰在水中的黏性較大，對藥材有一定包裹作用，不利于橙皮苷的提取，而采用NaOH沒有上述缺點[5]，本試驗中采用毒性較小的乙醇堿液提取，可提高橙皮苷提取率，文獻表明[3]提取液以pH=13為最佳，提取液澄清易過濾。

本文采用超聲波輔助堿水提取枳實中橙皮苷，通過單因素考察了超聲波堿水提取和酸沉工藝，并用正交試驗優(yōu)化了超聲波堿水提取工藝參數(shù)，結(jié)合橙皮苷含量測定，確定最適工藝條件為：采用4倍量65%乙醇-NaOH溶液（pH為13）50℃超聲3次每次50 min，加HCl調(diào)節(jié)pH=7，靜置析晶10 h，將提取產(chǎn)物用分光光度法進行橙皮苷含量測定，3批枳實樣品橙皮苷平均含量為32.3 mg/g。結(jié)果表明提取產(chǎn)率較高，方法簡便可行。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：I部 [M].北京：化學工業(yè)出版社,2005：172

[2]張冬松,高慧媛,吳立軍.橙皮苷的藥理活性研究進展 [J].中國現(xiàn)代中藥,2006,8(7)：25-27

[3]楊志學,王余兵,劉彥,等.正交設計優(yōu)選枳實中橙皮甙提取分離工藝研究[J].懷化醫(yī)專學報,2003,2(1)：45-48

[4]郝云彬,葉興乾,徐黎,等.超聲技術(shù)在橘皮中提取橙皮苷的應用[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2005,31(11)：63-66

[5]信維平,孫建華,祁宏.陳皮中陳皮甙的提取和應用的研究[J].食品研究與開發(fā),2008,27(2)：154-156

Study on the Ultrasonic-Associated Alkali Extraction of Hesperidin from Citrus Aurantium

CHEN Xiao-wei,CHEN Rong-yan,WEI Yuan-yuan,LIAO Lan,QIN Yan-ling
（Department of Biological and Chemical Engineering,Guangxi University of Technology,Liuzhou 545006,Guangxi,China）

2009-09-29

廣西工學院2009年大學生科研立項項目(No.2009030)；廣西教育廳科研項目(200911LX185)

陳曉偉（1976—），男（漢），講師，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)。