朱曉霞,張勇,羅學(xué)剛

（西南科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽(yáng)621010）

天麻多糖的結(jié)構(gòu)表征

朱曉霞,張勇,羅學(xué)剛

（西南科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽(yáng)621010）

對(duì)分離提純得到的川產(chǎn)天麻多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果如下：天麻粗多糖重均分子量為4.23×105，分散系數(shù)3.66，最大值達(dá)到1.38×106u。經(jīng)HPLC分析，GPSa的分子量為4.97×105u，主要由葡萄糖構(gòu)成，還含有少量的鼠李糖和甘露糖，其鼠李糖∶甘露糖∶葡萄糖=1∶1.07∶67.24。經(jīng)紅外光譜（IR）、1H和13C核磁共振（NMR）結(jié)構(gòu)分析確定其糖鏈主要結(jié)構(gòu)為α-(1→4)吡喃型D-葡萄糖。

天麻;多糖;結(jié)構(gòu)

Abstract:Analyzing the structure of the Gastrodia elata BL polysaccharides which produce from SichuanProvince and the results showed those as follow.The weight-average molecular weight of GPS is 4.23×105u,dispersible modulus is 3.66 and the max molecular weight is 1.38×106u.The molecular weight of GPSa is 4.97×105u by analyzed with HPLC.It was made up of glucose,little rhamnose and mannose（the rate is 67.24∶1∶1.07）.Then through IR,1H,13C NMR,the results showed that the main polysaccharide chain was α-(1→4).

Key words：Gastrodia elata BL.;polysaccharides;structure

多糖的結(jié)構(gòu)是其生物活性和功能的基礎(chǔ)，認(rèn)識(shí)和了解多糖的結(jié)構(gòu)有助于更好地利用和開(kāi)發(fā)多糖[1]。多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)與其生物功能關(guān)系密切，與蛋白質(zhì)相似，多糖也是大分子，結(jié)構(gòu)上可以分成一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)[2]。多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)是指糖基的組成，糖基排列順序，相鄰糖基的連接方式，異頭碳構(gòu)型以及糖鏈有無(wú)分支，分支的位置與長(zhǎng)短等。由于多糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性,在多糖一級(jí)結(jié)構(gòu)的分析中,往往需要使用多種方式的測(cè)試手段獲得糖鏈的一級(jí)結(jié)構(gòu)信息，目前國(guó)內(nèi)植物多糖的研究報(bào)道較多[3-5]。本文對(duì)本實(shí)驗(yàn)室分離提純所得到的天麻多糖GPSa進(jìn)行凝膠過(guò)濾分子量分析、單糖組分分析、紅外（IR）和核磁共振（1HNMR和1CNMR）掃描等初步表征。

1 材料和方法

1.1 原料、試劑材料及儀器

生物質(zhì)化學(xué)衍生物四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離提純后所得到的多糖組分；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品Dextran T-2000，T-500，T-70，T-40，T-10(Pharmacia，瑞典)。

1.2 儀器設(shè)備

Waters 2695 Alliance高效液相色譜系統(tǒng)：成都雅源科技有限公司；Empower色譜工作站：美國(guó)Waters公司；Shodex OHpak SB-804HQ多糖分析柱：江蘇漢邦科技有限公司；Shodex OHpak SB-G保護(hù)柱：浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司；Waters 2420 ELS Detector：美國(guó)Waters公司；示差檢測(cè)器：日本Shodex公司。

2 方法

2.1 GPSa理化性質(zhì)分析

1）物理性質(zhì)：觀察多糖形狀、顏色、氣味，在水中及有機(jī)溶劑中的溶解性及pH值。

2）化學(xué)性質(zhì)：苯酚－硫酸法反應(yīng)，茚三酮法檢測(cè)蛋白質(zhì)，淀粉－KI試紙?jiān)囼?yàn)。

2.2 純度檢測(cè)

取測(cè)試樣品GPSa 1 mg溶于1 mL蒸餾水，10000 r/min離心10 min，取上清10 μL上樣，記錄洗脫曲線(xiàn)用于判定該多糖組分的純度。

本實(shí)驗(yàn)室的HPSEC的具體測(cè)試條件如下：

Waters高效液相色譜系統(tǒng)（2695 HPLC Pump，Inline Degasser，2414Refractive Index Detector 與 2487 DualλAbsorbance Detector平行檢測(cè)，TSK PWXL 4000-3000串聯(lián)柱）。

流動(dòng)相為pH為7.0的0.1mol/LNaH2PO3和0.3mol/L NaNO3。

流速為 0.6 mL/min，柱溫（30±0.1）℃。

2.3 分子量測(cè)定

以不同標(biāo)準(zhǔn)分子量的葡聚糖Detxran-T系列（分子量4000至200萬(wàn)的10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品）作對(duì)照，用高效液相色譜法測(cè)定，由lgMw對(duì)tR作圖獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，然后在相同條件下獲得樣品層析圖譜，通過(guò)GPC計(jì)算機(jī)軟件計(jì)算分子量。

2.4 單糖組成測(cè)定

本文采用氣相色譜法，分析時(shí)由于樣品在氣相中傳遞速度更快，再加上應(yīng)用毛細(xì)管柱、程序升溫技術(shù)和采用更靈敏的檢測(cè)器（如氫離子火焰化檢測(cè)器），使得糖類(lèi)分離具有選擇性強(qiáng)、分辨力好、靈敏度高以及分析速度快等優(yōu)點(diǎn)。但是由于糖類(lèi)不容易揮發(fā)，必須預(yù)先進(jìn)行衍生化，成為易揮發(fā)、對(duì)熱較穩(wěn)定的衍生物。在糖進(jìn)行衍生化這一步驟，由于衍生化不充分，以及生成非目標(biāo)衍生物的其它副產(chǎn)物，易對(duì)分析造成干擾。

2.5 紫外光譜分析

稱(chēng)取樣品GPSa 3 mg，用蒸餾水配制成1 mg/mL的溶液，在200 nm～300 nm下進(jìn)行紫外全掃描。

2.6 紅外光譜（Infrared spectroscopy，IR）分析

紅外操作：取GPSa2mg充分干燥的組分，與200mg經(jīng)干燥的KBr粉末在瑪瑙研缽中細(xì)細(xì)研磨均勻，再經(jīng)壓片機(jī)壓片，上機(jī)4000cm-1～400cm-1波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。

2.7 一維核磁共振（NMR）

NMR檢測(cè)：取50 mg天麻多糖單組分GPSa溶于0.5 mL D2O，在常溫下，上機(jī)進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 GPSa理化性質(zhì)

呈白色粉末狀固體，無(wú)異味，可溶于水，易溶于熱水，不溶于乙醇、甲醇、丙酮等有機(jī)溶劑，pH值為6.3。苯酚－硫酸反應(yīng)陽(yáng)性，茚三酮反應(yīng)為陰性，說(shuō)明多糖中無(wú)蛋白質(zhì)存在；此多糖不能使淀粉－KI試紙變蘭，說(shuō)明GPSa為非淀粉多糖。

3.2 分子量確定

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

取標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖 Dextran T-2000、T-500、T-70、T-40、T-10,配制成2%的溶液，12000 r/min離心10 min，上清液用來(lái)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，進(jìn)樣量10 μL，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

以保留時(shí)間tR對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品Mw的對(duì)數(shù)值進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程為lgMw=-0.2813×tR+9.693,R2=0.9955，Mw 線(xiàn)性范圍為 104u～2×106u。

3.2.2 粗多糖分子量測(cè)定

粗多糖的分子量確定：將提取的天麻多糖除蛋白后，冷凍干燥成粉末，送樣到中國(guó)科學(xué)院成都分院分析測(cè)試中心測(cè)定。結(jié)果如表1。

表1 粗多糖分子量Table 1 Molecular weight of wide polysaccharide

常用的平均分子量有以數(shù)量為統(tǒng)計(jì)權(quán)重的數(shù)均分子量(Mn)和以重量為統(tǒng)計(jì)權(quán)重的重均分子量(MW)。天麻粗多糖的分散系數(shù)為3.66，說(shuō)明天麻粗多糖分子量分布特別分散，最大值達(dá)到1.38×106u。

3.3 純度鑒定及GPSa分子量測(cè)定

GPSa的HPLC圖譜如圖2所示，GPSa經(jīng)高效液相色譜測(cè)定其在HPLC中為單一對(duì)稱(chēng)峰，表明其為均一組分。由圖2可知，組分GPSa的洗脫時(shí)間為14.21 min，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可得分子量為4.97×105u。

3.4 單糖組成

圖3為標(biāo)準(zhǔn)糖樣中單糖的氣相色譜圖與天麻多糖的氣相色譜圖。

從GC圖譜可知，GPSa主要是由葡萄糖構(gòu)成，還含有少量的鼠李糖和甘露糖，鼠李糖：甘露糖：葡萄糖=1∶1.07∶67.24。15.886,20.877 兩處峰在標(biāo)準(zhǔn)品中未出現(xiàn)，其對(duì)應(yīng)的單糖在樣品中含量很小，不影響樣品主要組成。

圖2 GPSa的HPLC圖譜Fig.2 HPLC elution of GPSa

圖3 標(biāo)準(zhǔn)糖樣中單糖的氣相色譜圖與天麻多糖的氣相色譜圖Fig.3 GC of the monosaccharides in standard sample and GPSa

3.5 紫外分析

圖4為GPSa紫外掃描圖。

對(duì)多糖在200 nm～300 nm進(jìn)行紫外全掃描，結(jié)果顯示在280 nm和260 nm處都沒(méi)有吸收峰，說(shuō)明此均一多糖不含蛋白質(zhì)和核酸。

3.6 紅外光譜分析

圖5為GPSa的紅外光譜圖。

圖4 GPSa紫外掃描圖Fig.4 The UV scanning curve of GPSa

圖5 GPSa的紅外光譜圖Fig.5 IR spectrum of GPSa

從紅外光譜分析，該糖具有多糖特征，多糖的吸收譜帶：其在3434 cm-1有強(qiáng)且寬的-OH吸收峰，系多糖上的－OH形成的分子間、內(nèi)氫鍵；在2925 cm-1附近的峰為飽和C-H伸縮振動(dòng)(為-CH、-CH2的吸收峰)信號(hào)，中等強(qiáng)度；在1630 cm-1左右的峰是多糖水合振動(dòng)峰；在1730 cm-1沒(méi)有糖醛酸的吸收峰；在1300cm-1～1250 cm-1處沒(méi)有吸收峰，表明無(wú)磷酸基取代；1247cm-1處的應(yīng)為磺酸基的S=O伸縮振動(dòng)峰；1103cm-1、1080cm-1、1024 cm-1三個(gè)峰為吡喃糖環(huán)特征吸收峰，是其糖苷鍵C-O-C的非對(duì)稱(chēng)振動(dòng)峰，吸收很強(qiáng)；紅外光譜在890cm-1附近無(wú)吸收峰，而在837 cm-1（844±8）cm-1峰范圍內(nèi)，為α構(gòu)型）處形成峰，表明組成單糖為α－D－葡萄吡喃糖，另外在875 cm-1和810 cm-1處無(wú)吸收，表明不含甘露吡喃糖、半乳吡喃糖。

3.7 一維核磁共振

圖6和圖7分別是天麻多糖單組分GPSa的1HNMR和13CNMR，從譜圖中可得出葡聚糖的主要信息。

圖6 GPSa的1H核磁共振譜圖（30℃）Fig.6 1H NMR spectrum of GPSa at 30℃

在1H譜中，5.44×10-6g/L處有異頭碳C1上質(zhì)子的氫位移，表明這些葡萄糖殘基均為α型吡喃糖，這與紅外光譜分析一致。在13C譜中，102.466×10-6g/L處化學(xué)位移表明C-1發(fā)生取代；在87.5×10-6g/L左右沒(méi)有發(fā)生互相位移，表明沒(méi)有C-3發(fā)生取代；在69×10-6g/L處沒(méi)有化學(xué)位移，表明沒(méi)有發(fā)生取代的C6。所以此糖鏈可能的主鏈結(jié)構(gòu)為1－4連接。

4 結(jié)論

1)單組分GPSa的理化性質(zhì)：呈白色粉末狀固體，無(wú)異味，可溶于水，易溶于熱水，不溶于乙醇、甲醇、丙酮等有機(jī)溶劑，pH值為6.3。GPSa不含蛋白質(zhì)，為非淀粉多糖。

2)天麻粗多糖重均分子量為4.23×105u，分散系數(shù)3.66，最大值達(dá)到 1.38×106u。經(jīng) HPLC 分析，GPSa的分子量為4.97×105u。

3)單組分GPSa經(jīng)GC分析：GPSa主要是葡萄糖構(gòu)成，還含有少量的鼠李糖和甘露糖，鼠李糖：甘露糖：葡萄糖=1∶1.07∶67.24。

4)單組分GPSa經(jīng)紅外光譜（IR）、1H和13C核磁共振（NMR）結(jié)構(gòu)分析確定其糖鏈為α-(1→4)吡喃型D-葡萄糖。

[1]楊世林,蘭進(jìn),徐錦堂.天麻的研究進(jìn)展[J].中草藥,2000,31(1)：66-69

[2]張宏杰,周建軍,李新生.天麻研究進(jìn)展[J].氨基酸和生物資源,2003,25(1)：17-20

[3]楊云.孟江,馮衛(wèi)生.大棗酸性多糖ZJ-6的化學(xué)研究[J].食品科學(xué),2004,25(5)：55-58

[4]林娟,邱宏端,林霄.甘薯多糖的提取純化及成分分析[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2003,18(2)：64-66

[5]劉方明,李志孝,孟延發(fā).紅芪多糖RHG的分離純化及化學(xué)結(jié)構(gòu)[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),1997,32(8)：603-606

Studies on Structure Characterization of Gastrodia Elata BL Polysaccharides

ZHU Xiao-xia，ZHANG Yong，LUO Xue-gang
（School of Material Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010，Sichuan,China）

2010-05-10

朱曉霞（1982—），女（漢），助教，碩士，從事天然生物大分子研究。