江 雪,方顯明

一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)是催化一氧化氮(nitric oxide,NO)合成的關(guān)鍵酶。有研究表明[1],NO與慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。Junus激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子通路(Junus kinnases-signal transducer and activators of transcription,JAK-STAT)是CHF發(fā)病的重要機(jī)制之一。而目前JAK1被認(rèn)為是JAKs家族中激活STAT通路的主要激酶[2]。但NO與JAK1關(guān)系的研究鮮見報(bào)道。本研究擬通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn),探討CHF過程中NO與JAK1的關(guān)系及安心顆粒干預(yù)的作用。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠72只,雌性,體重(180±20)g,由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào):SCXK桂2003-0003)。

1.1.2 藥物與試劑 藥物:安心顆粒[每包3.5 g,含生藥4.5 g,由培力(南寧)藥業(yè)有限公司提供,批號(hào) 060301];卡托普利片(每片25 mg),由湖南湘雅制藥有限公司生產(chǎn),批號(hào)0710104;鹽酸阿霉素(adriamycin,ADR)粉針,由浙江海正藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批號(hào)071101A。試劑:JAK1多克隆抗體(一抗),羊抗兔多克隆抗體(二抗)均購于美國 SANTA CRUZ公司。NO、NOS試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.1.3 儀器 BL-420E+生物信號(hào)采集系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司);高速冷凍離心機(jī)5810R型(德國 Eppendorf公司);凝膠成像分析系統(tǒng)(美國ALPHA公司);基礎(chǔ)電泳儀、垂直電泳槽、可編程高壓電泳儀Power3000、電轉(zhuǎn)槽153BR53477(美國BIO-RAD公司);全自動(dòng)酶標(biāo)儀(奧地利CliniBio公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備 參照文獻(xiàn)[3]方法,將注射用阿霉素粉針用滅菌生理鹽水5 mL溶解,生理鹽水稀釋配成每l mL生理鹽水含藥0.8 mg溶液,1周～3周按3 mg/kg劑量給模型組和用藥組大鼠行腹腔注射,4周～6周以2 mg/kg劑量,1次/周;正常對(duì)照組注射等量的生理鹽水,1次/周。均連續(xù)注射給藥6周。造模過程中觀察并記錄大鼠表征及行為改變情況。

1.2.2 動(dòng)物分組與給藥 72只SD大鼠隨機(jī)分為6組:正常對(duì)照組(A組)、模型組(B組)、卡托普利組(C組)、安心顆粒小劑量組(D組)、安心顆粒中劑量組(E組)、安心顆粒大劑量組(F組)。每組12只。C組、D組、E組、F組分別給予卡托普利劑量6.25 mg/(kg?d)、安心顆粒 0.8 g/(kg?d)、安心顆粒1.2 g/(kg?d)和安心顆粒1.6 g/(kg?d)灌胃(藥物劑量按動(dòng)物與人體表面積等量換算),A組、B組予等容生理鹽水灌胃,每日1次,共 6周。實(shí)驗(yàn)中,室溫控制在(20±2)℃,大鼠飲食自由,飲水不限。

1.2.3 心功能指標(biāo)測定 末次灌胃給藥24 h內(nèi),大鼠用4%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉,取頸前正中切口,分離頸總動(dòng)脈,用肝素抗凝的導(dǎo)管經(jīng)右頸總動(dòng)脈插入左心室并固定,經(jīng)壓力換能器將導(dǎo)管與微機(jī)相連,通過BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行監(jiān)測。分別測定心率(HR)、動(dòng)脈收縮壓(SAP)、動(dòng)脈舒張壓(DAP)、左室收縮壓(LVSP)、左室舒張期末壓(LVEDP)、左室內(nèi)壓變化速率(±dp/dtmax)等指標(biāo)。然后剖胸取出心臟,PBS液冰浴清洗,用濾紙拭干后稱取整個(gè)心臟。稱重后-80℃保存。心臟質(zhì)量指數(shù)(heart mass index,HMI)按公式計(jì)算:HMI=心臟重量(HW)/體重(BW)[4]。

1.2.4 血清NO、NOS測定 于大鼠股動(dòng)脈取血,經(jīng)4℃4 000 r/min離心15 min,分離出血清,置于-80℃冰箱中備測。NO和NOS測定用化學(xué)比色法,按試劑盒說明書操作。

1.2.5 心肌蛋白質(zhì)測定 采用Western Blot法,將心肌組織剪碎,加入裂解緩沖液,冰浴下勻漿,4℃12 000 r/min離心15 min,取上清,加入上樣緩沖液,用酶標(biāo)儀測定 A562,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品蛋白質(zhì)濃度?？偟牡鞍滋崛∥锝?jīng)8%SDS-PAGE電泳、將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,然后按照標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)印跡法與1∶300稀釋的抗JAK1多克隆抗體冰上孵育1.5 h后,洗脫,5%脫脂奶粉冰上封閉 1 h,漂洗后加入1∶5 000稀釋的二抗,室溫下孵育1 h后,洗脫,予化學(xué)發(fā)光試劑增強(qiáng)反應(yīng),X光壓片曝光,漂洗顯影,用薄層掃描儀測定條帶的密度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠行為學(xué)變化 實(shí)驗(yàn)觀察到,A組大鼠毛色光澤,雙眼靈活有神,行動(dòng)敏捷,對(duì)周圍變化靈敏。B組從第2次腹腔注射ADR后出現(xiàn)活動(dòng)減少、蜷縮、納食減少、皮毛松軟、脫毛、體重減輕等,第4次注射后出現(xiàn)程度不一的腹水,尿少便溏,呼吸減弱,口唇及雙耳發(fā)紺等,并開始出現(xiàn)死亡。C組、D組、E組、F組從第 3次腹腔注射ADR后逐漸出現(xiàn)活動(dòng)減少、蜷縮、納食減少、皮毛松軟、體重減輕等,但較B組輕;第5次注射后少數(shù)大鼠出現(xiàn)腹水、呼吸減弱,口唇發(fā)紺等。實(shí)驗(yàn)過程中,存活大鼠共66只。

2.2 各組心功能指標(biāo)改變 造模6周后,與正常對(duì)照組比,模型組 HR、SAP、DAP、LVSP、LVEDP、HMI均增高(P ＜0.01),而±dp/dtmax均降低(P＜0.01),提示左心室后負(fù)荷增加、心肌肥厚和心肌收縮力下降已存在,心力衰竭模型造模成功。與模型組比較,各用藥組 HR、SAP 、DAP 、LVSP、LVEDP 、HMI均降低(P＜0.05或 P＜0.01),±dp/dtmax顯著升高(P＜0.01)。提示安心顆粒與卡托普利相似,有改善心功能的作用。詳見表1、表2。

表1 各組大鼠 HR、SAP、DAP、HM I的比較( ±s)

表1 各組大鼠 HR、SAP、DAP、HM I的比較( ±s)

組別 n HR(bp/m) SAP(mmHg) DAP(mmHg) HM I A組 11 347.5±17.7 120.6±7.6 76.2±8.0 3.7±0.2 B組 11 393.7±12.42) 150.2±7.02) 93.7±4.42) 5.1±0.42)C組 11 368.1±12.44) 131.9±7.14) 83.5±7.14) 4.3±0.14)D組 11 369.6±8.34) 135.9±5.04)7) 85.3±4.34)7) 4.3±0.24)8)E組 11 366.2±8.54) 128.0±6.34) 76.9±8.04)5) 3.9±0.24)6)F組 11 389.4±5.26)8) 136.9±5.14)8) 84.9±4.04)7) 4.8±0.43)6)8)與A組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與B組比較,3)P＜0.05,4)P＜0.01;與C組比較,5)P＜0.05,6)P＜0.01;與E組比較,7)P＜0.05,8)P＜0.01

表2 各組大鼠LVSP、LVEDP、±dp/dtmax比較( ±s)

表2 各組大鼠LVSP、LVEDP、±dp/dtmax比較( ±s)

組別 n LVSP(mmHg) LVEDP(mmHg) +dp/dtmax(mmHg/s) -dp/dtmax(mmHg/s)A組 11 158.0±9.4 3.4±2.8 3 352.7±514.1 2 626.4±509.5 B組 11 185.6±15.01) 11.7±3.31) 1 176.2±231.01) 861.9±91.71)C組 11 174.4±8.22) 8.1±2.43) 2 119.7±395.83) 1 830.5±258.03)D組 11 173.2±12.62) 6.6±2.33) 2 401.7±581.93) 2 230.1±486.83)4)5)E組 11 171.3±11.82) 6.8±2.23) 2 102.3±392.63) 1 761.0±443.33)F組 11 170.2±10.02) 5.8±2.13)4) 1 870.1±315.53) 1 428.5±548.83)與A組比較,1)P＜0.01;與B組比較,2)P＜0.05,3)P＜0.01;與C組比較,4)P＜0.05;與E組比較,5)P＜0.05

2.3 各組血清 NO、NOS濃度比較 B組 NO、NOS血清濃度均高于A組(P＜0.01);而C組、D組、E組及F組 NO、NOS濃度均低于 B組(P＜0.05或P＜0.01),各用藥組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表3。

表3 各組給藥后血清NO、NOS濃度比較( ±s) mmol/L

表3 各組給藥后血清NO、NOS濃度比較( ±s) mmol/L

組別 n NO(μ mol/L) NOS(U/mL)A組 11 25.7±13.5 28.8±10.1 B組 11 55.4±10.81) 56.2±14.61)C組 11 36.7±13.23) 37.2±11.63)D組 11 41.5±15.22) 46.8±10.6 E組 11 34.6±9.13) 39.2±11.13)F組 11 39.7±12.62) 50.4±5.8與A組比較,1)P＜0.01;與B組比較,2)P＜0.05,3)P＜0.01

2.4 各組大鼠心肌JAK1蛋白表達(dá)及灰度(見圖1、表4) B組JAK1蛋白表達(dá)均高于A組(P＜0.01);C組、E組、F組蛋白表達(dá)均低于B組(P＜0.05或 P＜0.01),各用藥組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1 各組大鼠心肌JAK1蛋白表達(dá)

表4 各組大鼠心肌JAK1蛋白灰度值表達(dá)(±s)

表4 各組大鼠心肌JAK1蛋白灰度值表達(dá)(±s)

組別 n JAK1/GAPDH A組 11 8.2±2.0 B組 11 19.0±4.61)C組 11 13.6±2.83)D組 11 17.0±4.6 E組 11 15.2±3.82)F組 11 14.7±3.42)與A組比較,1)P＜0.01;與B組比較,2)P＜0.05,3)P＜0.01

3 討 論

已往的研究表明,CHF患者有血管內(nèi)皮功能異常。心力衰竭時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO增多,NO過度增多可對(duì)心肌造成直接損害,降低心肌收縮力[5]。心力衰竭時(shí)有廣泛的心肌細(xì)胞凋亡存在,在CHF的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,B組血清NO、NOS濃度均增高,提示大鼠在CHF形成的過程中,血管內(nèi)皮細(xì)胞NO、NOS代償性的分泌增多。給予安心顆粒,可降低血清 NO、NOS濃度,與卡托普利作用相似,提示安心顆粒有抑制NO、NOS和心肌細(xì)胞凋亡作用。

CHF發(fā)病與多種致病機(jī)制共同參與有關(guān),其中JAK-STAT信號(hào)通路是一個(gè)重要的發(fā)病機(jī)制。目前已知JAKs家族成員有4 個(gè)(JAK1、JAK2、JAK3、TyK2),JAK1作為 JAKs家族成員之一,在各種細(xì)胞因子及其受體作用下,經(jīng)酪氨酸磷酸化后活性增強(qiáng),從而激活其下游的STAT信號(hào)分子,使JAK1-STAT3傳導(dǎo)通路持續(xù)活化。STAT3酪氨酸磷酸化后發(fā)生核轉(zhuǎn)位,結(jié)合特定的DNA序列,激活介導(dǎo)心肌肥厚相關(guān)基因,引發(fā)心肌重塑[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,給予安心顆粒,可使心力衰竭大鼠心肌JAK1的表達(dá)活性受到抑制,其作用與卡托普利相似。NOS分為原生型(cNOS)和誘生型(iNOS)。后者可在多種細(xì)胞中表達(dá),如炎性中性粒細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞等。有研究發(fā)現(xiàn)[8],JAK/STAT活化可使iNOS及NO合成增加,大量生成的NO最終引起血管病理性舒張塌陷、對(duì)血管收縮劑反應(yīng)性下降以及降低心肌收縮力等一系列病理改變。iNOS和NO的大量合成與多種機(jī)制有關(guān),其中JAK途徑有著非常重要的作用,抑制JAK1的活性可下調(diào)細(xì)胞iNOS的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,B組心肌JAK1蛋白表達(dá)增強(qiáng)時(shí)血清NO、NOS濃度亦升高,提示CHF形成過程中血清中NO、NOS水平與 JAK1活化有關(guān)。給予安心顆粒,可使心肌 JAK1蛋白表達(dá)下調(diào)及血清NO、NOS濃度降低。安心顆粒是由人參、桂枝、瓜蔞殼、水蛭、茯苓等藥組成,具有補(bǔ)氣通陽、化痰逐瘀、強(qiáng)心利尿之功。以往的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)該藥有抑制心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡、改善心功能的作用[9]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示該藥可通過抑制JAK1蛋白表達(dá),降低 NO、NOS的活性,阻斷JAK-STAT信號(hào)通路,抑制細(xì)胞凋亡和心肌重塑,改善心肌舒縮功能,從而達(dá)到防治CHF的目的。至于其作用機(jī)制,尚有待進(jìn)一步研究。

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