譚 琥,彭延古,黃 鶯,徐愛良,李路丹,易小民

血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelia cells,VEC)是鋪陳與血管壁內(nèi)側(cè)的一種多功能的細(xì)胞,對(duì)血栓與止血、炎癥與免疫和血管新生、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等多種生理病理過程具有重要的調(diào)節(jié)功能[1]。VEC在生理情況下具有強(qiáng)大的抗凝和抗血栓功能,但在某些病理及凝血酶、白介素-1(IL-1)和NEAV等的作用下卻表達(dá)出促凝活性[2]。正常情況下,內(nèi)皮細(xì)胞可分泌組織型纖溶酶原激活物(t-PA)和纖溶酶原激活物抑制劑(PAI),具有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)纖溶的功能。t-PA可促進(jìn)纖溶酶原活化,對(duì)纖溶有很強(qiáng)的促進(jìn)作用;而PAI可對(duì)其起到抑制作用,二者構(gòu)成一對(duì)平衡物質(zhì),共同維持機(jī)體纖溶功能的平衡穩(wěn)定。本研究以凝血酶-血管內(nèi)皮細(xì)胞建立模型為對(duì)象,研究全蝎純化液對(duì)凝血酶誘導(dǎo)的VEC纖溶功能改變的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(VEC-340)由武漢大學(xué)典型物種保存中心提供。全蝎購(gòu)自湖南省醫(yī)藥公司,經(jīng)水煮、醇沉,經(jīng)凝膠沉析、離子交換沉析等分離純化過程將其制備、凍干備用。凝血酶購(gòu)自Sigma公司,RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,小牛血清(FCS)購(gòu)自杭州四季青公司;胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,CO2培養(yǎng)箱為美國(guó) Sheldon Manufacturing inc公司產(chǎn)品,酶標(biāo)儀為芬蘭Labsystens集團(tuán)產(chǎn)品,倒置顯微鏡為日本Olympus產(chǎn)品,超凈工作臺(tái)為蘇州凈化設(shè)備公司提供。t-PA、PAI檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海太陽生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定 將VEC-340細(xì)胞株用Hank’s液清洗后以0.25%胰蛋白酶消化,用含10%FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液終止反應(yīng),離心棄上清液,用 RPMI 1640培養(yǎng)液(10%FCS,100 kU/L青霉素,100 kU/L鏈霉素,pH7.2)制成7.5×104/mL細(xì)胞懸液,接種于培養(yǎng)板中,37℃,5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2 d換液1次,待細(xì)胞長(zhǎng)融合后,用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)選用經(jīng)Ⅷ因子免疫熒光檢測(cè)并生長(zhǎng)良好的第2代～第3代內(nèi)皮細(xì)胞。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 同前培養(yǎng)的VEC-340融合后,隨機(jī)分為空白組、凝血酶(終濃度10 U/mL)組及全蝎大劑量(24 μ g/mL)、中劑量(12 μ g/mL)、小劑量(6 μ g/mL)組?？瞻捉M加入等量培養(yǎng)液。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 取上述各組培養(yǎng)液分別檢測(cè)t-PA,采用發(fā)射底物法。PAI采用發(fā)射底物法。方法參照試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用 t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

與空白組比較,凝血酶組t-PA活性降低,PAI活性增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),與凝血酶組比較,全蝎大劑量、中劑量、小劑量組t-PA活性均增高,PAI活性降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。詳見表1。

表1 全蝎純化液對(duì)凝血酶誘導(dǎo)VEC釋放t-PA、PAI活性的影響(±s)

表1 全蝎純化液對(duì)凝血酶誘導(dǎo)VEC釋放t-PA、PAI活性的影響(±s)

組別 孔數(shù)(孔) t-PA(kU/L) PAI(kAU/L)空白組 10 0.66±0.04 0.86±0.02凝血酶組 10 0.55±0.051) 1.69±0.121)全蝎大劑量組 10 1.08±0.122) 0.63±0.012)全蝎中劑量組 10 0.89±0.062) 0.97±0.022)全蝎小劑量組 10 0.75±0.072) 1.12±0.112)與空白組比較,1)P＜0.01;與凝血酶組比較,2)P＜0.01

3 討 論

血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅是血液與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的生理屏障,而且是高度活躍代謝庫,它既能合成和釋放多種抗栓、溶栓成分,如血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)、t-PA、前列環(huán)素(PGI2)、內(nèi)皮舒張因子(EDRF),而具有抗血小板聚集,擴(kuò)張血管和促纖溶作用,又能在受到刺激或損傷時(shí)釋放多種促血栓形成物質(zhì),如凝血因子、內(nèi)皮素、PAI,引起血栓形成[3-6]。對(duì)組織血管血栓形成和微循環(huán)障礙有重要影響。觀察 t-PA和PAI比值的變化可以評(píng)價(jià)纖溶系統(tǒng)的改變,并間接的反應(yīng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能[7]。t-PA和PAI是纖溶系統(tǒng)一對(duì)重要調(diào)節(jié)因子,t-PA是纖溶的重要生理性刺激劑,啟動(dòng)生理性纖溶,消除血管床上的纖維蛋白沉積,機(jī)體通過其來消除血管內(nèi)部適當(dāng)?shù)难ㄐ纬?PAI則是t-PA的快速抑制劑[8],可由VEC合成和分泌。內(nèi)皮細(xì)胞可以合成分泌多種血管活性物質(zhì),如 PAI-I、t-PA、血管性假血友病因子(vWF)、內(nèi)皮素(ET-1)、一氧化氮(NO)等,可調(diào)節(jié)血管張力,影響凝血纖溶功能,維持血管內(nèi)皮促血栓形成與抗血栓形成兩種作用之間的平衡[9]。兩者均可由VEC合成,t-PA活性降低,PAI活性增高,可導(dǎo)致血栓形成。t-PA和PAI作為反映纖溶的主要指標(biāo),同時(shí)亦反映血管內(nèi)皮功能。是調(diào)節(jié)纖溶系統(tǒng)功能的關(guān)鍵物質(zhì),因此兩者在血栓并發(fā)癥和心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

近年來研究表明,血栓性疾病的發(fā)生與t-PA和PAI含量及活性的變化有密切關(guān)系,凝血酶能增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的通透性,且這種反應(yīng)與內(nèi)皮細(xì)胞收縮反應(yīng)一致[10]。本實(shí)驗(yàn)觀察到全蝎純化液可明顯提高凝血酶誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞t-PA的活性,降低t-PA的活性,提示全蝎純化液抗栓、溶栓機(jī)制可能與影響VEC合成和分泌t-PA和PAI有關(guān)。由于t-PA的活性增強(qiáng),PAI活性減弱,而呈現(xiàn)纖溶作用,可防止血栓形成,使血栓溶解。至于全蝎純化液是通過何種途徑使內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌 t-PA和PAI發(fā)生改變,提示可能是其降低VEC的纖溶抑制物活性,從而使VEC的纖溶活性提高,對(duì)促進(jìn)血栓溶解有重要意義。

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