潘志強(qiáng)

(江蘇省鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院藥劑科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002)

枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide，LBP)是枸杞子經(jīng)脫脂、水提、反復(fù)醇析所得，含量為4% ～10%，是一種水溶性大分子物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗腫瘤、抗疲勞、護(hù)肝、防輻射、抗缺氧等功能，而諸多功能的發(fā)揮都源自于其對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用[1]。許多天然多糖是高分子化合物，無(wú)法通過(guò)機(jī)體屏障到達(dá)細(xì)胞而影響其生物學(xué)功能。對(duì)多糖進(jìn)行降解，得到適宜相對(duì)分子質(zhì)量的多糖片斷或寡糖，可以提高多糖的生物活性。師然新等[2]發(fā)現(xiàn)，相對(duì)分子質(zhì)量是影響角叉菜多糖抗腫瘤作用的重要因素，適當(dāng)減小可使抑瘤率升高，但太小又會(huì)使抑瘤率迅速降低，具有適中相對(duì)分子質(zhì)量的角叉菜多糖能保持高的抑瘤率，即多糖被降解至一定相對(duì)分子質(zhì)量范圍時(shí)能有效提高其抑瘤率。酶降解法可特異性、選擇性地切斷糖苷鍵。筆者研究了枸杞多糖經(jīng)酶降解為中相對(duì)分子質(zhì)量枸杞多糖后對(duì)小鼠的免疫系統(tǒng)的作用，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

藥品與試劑:酶降解得到的中相對(duì)分子質(zhì)量枸杞多糖(經(jīng)糖化酶降解，多糖含量高于81%，多角度激光光散射檢測(cè)器檢測(cè)2個(gè)極分的重均分子質(zhì)量(Mw)分別為1 7110和1 6840，由湖北大學(xué)中藥生物技術(shù)省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備;RPMI－1640培養(yǎng)液(GIBCO公司);小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)、SDS、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)均為 Sigma公司產(chǎn)品;噻唑藍(lán)(MTT，AMRESCO公司);印度墨水(北京篤信精細(xì)制劑廠(chǎng))。ConA用pH=7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)配成100 μg/mL的溶液，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

動(dòng)物:SPF級(jí)BALB/C小鼠160只，雌雄各半，體重18～22 g，由湖北省疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(鄂)2003－0005。

儀器:恒溫水浴鍋(北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器有限公司);TDL－5－A型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng));756PC型紫外分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司);電子天平;Sigma低溫離心機(jī);96孔板、酶標(biāo)儀;全自動(dòng)生化儀;記時(shí)秒表。

1.2 方法

1.2.1 免疫器官臟器指數(shù)測(cè)定

取40只BALB/C小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分成4組，每組10只。低、中、高劑量給藥組分別給予酶降解的中相對(duì)分子質(zhì)量枸杞多糖50，100，200 mg/(kg·d)，灌胃體積為 20 mL/kg，1 次 /d，連續(xù) 10 d;陰性對(duì)照組灌胃等體積生理鹽水(NS)。所有動(dòng)物均食用全價(jià)營(yíng)養(yǎng)配合飼料，自由攝食飲水。末次給藥12 h后，稱(chēng)體重后處死，取出動(dòng)物的脾臟、胸腺稱(chēng)重，并計(jì)算臟器指數(shù)[3]。臟器指數(shù)(%)=臟器質(zhì)量(g)÷動(dòng)物體重(g)×100。

1.2.2 小鼠炭粒廓清試驗(yàn)

取40只BALB/C小鼠，雌雄各半，分組及給藥處理同1.2.1項(xiàng)。連續(xù)給藥10 d后，按每10 g體重0.1 mL計(jì)算，于小鼠尾靜脈注射印度墨汁(將原液用生理鹽水稀釋5倍)，待墨汁注入后立即計(jì)時(shí)。分別于注射后2 min和10 min時(shí)從眼眶靜脈叢取血20 μL，加入到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，以Na2CO3溶液作空白對(duì)照，于600 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度(A)值。將小鼠處死，取脾臟、肝臟，稱(chēng)重。計(jì)算吞噬指數(shù)(K)及校正吞噬指數(shù)(a)，表示小鼠炭粒廓清的能力[4]。吞噬指數(shù)(K)=脾重)。K為直線(xiàn)斜率，可表示吞噬速率;a可反映每單位組織質(zhì)量的吞噬活性。

1.2.3 小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)(改良MTT法)

取40只BALB/C小鼠，雌雄各半，分組及給藥處理同1.2.1項(xiàng)。末次給藥4h后處死小鼠，以75%的酒精浸泡消毒，無(wú)菌條件解剖小鼠，取脾，剔除結(jié)締組織和脂肪并剪碎脾臟后，研碎，200目細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾，用Hanks液洗3次，懸液收集到無(wú)菌離心管，1 500 r/min轉(zhuǎn)速離心2 min，棄上清液，用Hanks液洗滌細(xì)胞2次，用RPMI－1640培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋成5×106個(gè)/mL，制成單細(xì)胞懸液。每只動(dòng)物的脾細(xì)胞懸液分別加12個(gè)孔，1～4孔為對(duì)照孔，加入90 μL脾細(xì)胞懸液，10 μL RPMI－1640培養(yǎng)液(100 IU/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素，10%小牛血清);5～8孔為加ConA孔，加入90 μL 脾細(xì)胞懸液，50 μg/mL 的 ConA 液 10 μL;9～12 孔為加LPS 孔，加入 90 μL 脾細(xì)胞懸液，100 μg/mL 的 LPS 液 10 μL。置5%CO2，37 ℃ 培養(yǎng)，于培養(yǎng)第 68 h，各孔加入 10 μL MTT 溶液(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入100 μL酸性二甲基亞砜(DMSO)溶液，振蕩，于室溫放置15 min，用酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度 A值。T淋巴細(xì)胞的增殖能力=ConA孔的 A值－對(duì)照孔的 A值，B淋巴細(xì)胞的增殖能力=LPS孔的 A值－對(duì)照孔的 A值。

1.2.4 環(huán)磷酰胺模型小鼠免疫功能影響試驗(yàn)

取40只BALB/C小鼠，雌雄各半，分組及給藥處理同1.2.1項(xiàng)。連續(xù)給藥10 d，第6天給藥2 h后腹腔注射環(huán)磷酰胺(按100 mg/kg體重計(jì)算，每天重復(fù)注射同樣劑量至第10天)，小鼠稱(chēng)重。從小鼠眼眶取血0.5 mL，放入肝素處理的離心管中進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù);另取胸腺、脾臟稱(chēng)重，計(jì)算臟器指數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

2 結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 酶降解的LBP對(duì)小鼠免疫器官臟器指數(shù)的影響(n=10，±s)

表1 酶降解的LBP對(duì)小鼠免疫器官臟器指數(shù)的影響(n=10，±s)

注:與陰性對(duì)照組比較，△P ＜0.05，▲P ＜0.01。

B淋巴細(xì)胞增殖影響試驗(yàn)(A570)組別 劑量 臟器指數(shù) 炭粒廓清試驗(yàn) 脾臟T淋巴細(xì)胞增殖影響試驗(yàn)(A570)陰性對(duì)照組低劑量給藥組中劑量給藥組高劑量給藥組等體積NS 50 mg/kg 100 mg/kg 200 mg/kg胸腺指數(shù)0.211 ± 0.062 0.252 ± 0.031 0.294 ±0.039▲0.263 ±0.045△脾指數(shù)0.481 ±0.073 0.492 ± 0.064 0.515 ± 0.065△0.561±0.073△吞噬指數(shù) K(min－1)0.015 66 ±0.003 5 0.019 7 ±0.006 7 0.125 9 ±0.024 3▲0.032 4 ±0.002 9▲校正吞噬指數(shù) a 3.23 ± 0.76 3.52 ± 0.88 4.87 ±0.91△4.11 ±0.78△未加ConA孔0.288 ±0.040 0.311 ± 0.009 0.309 ± 0.014 0.305 ±0.007加ConA孔0.303 ± 0.056 0.352 ± 0.038 0.391 ±0.014△0.341 ±0.009 ConA差值0.015 ±0.007 0.041 ± 0.006 0.082 ±0.011△0.036 ±0.014未加LPS孔0.259 ±0.035 0.297 ± 0.067 0.302 ± 0.041 0.324 ±0.029加LPS孔0.283 ± 0.076 0.331 ± 0.074 0.387 ±0.091△0.401 ±0.078△LPS差值0.024 ±0.005 0.034 ± 0.006 0.085 ± 0.011△0.077±0.008△

表2 環(huán)磷酰胺模型小鼠免疫功能影響試驗(yàn)(n=10，±s)

表2 環(huán)磷酰胺模型小鼠免疫功能影響試驗(yàn)(n=10，±s)

注:與模型對(duì)照組比較，□P ＜0.05，■P ＜0.01。

組別模型對(duì)照組正常對(duì)照組低劑量給藥組中劑量給藥組高劑量給藥組藥物及劑量環(huán)磷酰胺組NS 50 mg/kg 100 mg/kg 200 mg/kg白細(xì)胞數(shù)(106/mm3)3.66 ± 0.0712 9.46 ± 0.1132■5.42 ± 0.0872□6.57 ± 0.0896□5.58 ± 0.0749□胸腺指數(shù)0.091 ± 0.02 0.211 ± 0.36■0.152 ± 0.033□0.193 ± 0.035■0.164 ± 0.042□脾指數(shù)0.391 ± 0.101 0.585 ± 0.083■0.487 ± 0.054□0.575 ± 0.062■0.572 ± 0.071□

3 討論

脾臟中以B淋巴細(xì)胞為主調(diào)節(jié)體液免疫。巨噬細(xì)胞參與機(jī)體的特異性和非特異性免疫，具有強(qiáng)大的殺傷和清除作用，還能分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫，并將抗原提呈給T及B淋巴細(xì)胞[5]。多糖的生物活性與其相對(duì)分子質(zhì)量、空間構(gòu)象、硫酸根含量等有關(guān)。中相對(duì)分子質(zhì)量多糖的活性大于高相對(duì)分子質(zhì)量和低相對(duì)分子質(zhì)量多糖;具有β螺旋型立體結(jié)構(gòu)的多糖有較強(qiáng)的抗病毒活性?？赏ㄟ^(guò)化學(xué)法、酶法等降解高相對(duì)分子質(zhì)量的多糖，以及采用硫酸化、乙?；确椒ㄐ揎椂嗵且蕴岣咂渖飳W(xué)活性[5]。酶降解的枸杞多糖相對(duì)分子質(zhì)量由30 000降到17 000左右。本研究表明:中相對(duì)分子質(zhì)量的枸杞多糖可顯著增加小鼠脾臟指數(shù);可顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，提高機(jī)體對(duì)病原微生物的抵抗力;可顯著促進(jìn)T及B淋巴細(xì)胞的增殖，從而增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫功能。另外，所有小鼠免疫試驗(yàn)結(jié)果均無(wú)量效依賴(lài)關(guān)系，但酶降解的枸杞多糖中劑量組效果均較好，說(shuō)明多糖類(lèi)都有一個(gè)最適效應(yīng)量，大于這個(gè)劑量反而效果下降甚至產(chǎn)生免疫抑制[6－8]。另外，中相對(duì)分子質(zhì)量的枸杞多糖增強(qiáng)了機(jī)體的特異性和非特異性免疫功能，可以增加環(huán)磷酰胺所致免疫功能低下小鼠的胸腺指數(shù)、脾指數(shù)以及提高白細(xì)胞數(shù)目，是一種具有良好開(kāi)發(fā)前景的免疫調(diào)節(jié)劑。對(duì)于酶降解的中相對(duì)分子質(zhì)量枸杞多糖的分子空間構(gòu)象、化學(xué)修飾與免疫作用的關(guān)系，尚需深入研究。

致謝:本實(shí)驗(yàn)得到了湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院杜鵬副教授的熱忱幫助。

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