李 勇，高 倩，曹英杰，李 娜，賈景明

(沈陽藥科大學，遼寧 沈陽 110016)

北蟲草 Cordyceps militaris(L.)Link又名蛹蟲草，是我國名貴中藥材之一[1]，主要分布于吉林、遼寧、陜西、河北等地[2]。蟲草素(3'－脫氧腺苷，3'－deoxyadenosine)亦稱蟲草菌素(cordycepin)，是一種核苷類抗生素[3]，最初蟲草素是從蛹蟲草培養(yǎng)物中分離得到[4－5]，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎等多種藥理活性[6－8]。其在蛹蟲草中的含量明顯高于冬蟲夏草[9]，是北蟲草中一種重要的化學成分。本試驗探討了添加不同種類、不同濃度的真菌誘導子對蛹蟲草液體培養(yǎng)中蟲草素產(chǎn)量的影響，并以北蟲草的菌絲體干重和蟲草素為指標篩選出對北蟲草生長和蟲草素有促進作用的真菌誘導子，為利用北蟲草深層發(fā)酵蟲草素提供合理配方，以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要，同時也為功能性保健食品的進一步開發(fā)提供科學依據(jù)。報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

島津高效液相色譜儀(日本島津);HU3120B型超聲處理器(北京來亨科學儀器有限公司);FA2104型電子分析天平(上海民橋精密科學儀器有限公司);JT－150型超級凈化工作臺(沈陽利港凈化設(shè)備有限公司);HN101型數(shù)顯鼓風干燥箱(南通滬南科學儀器有限公司)。蟲草素(中國藥品生物制品檢定所，批號為 858－200202);鹽酸噻胺(北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司);核黃素(北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司);甲醇、乙腈(康科德，色譜純)，水(娃哈哈純凈水)，其他試劑(分析純)。菌種為北蟲草 Cordyceps militaris(L.)Link，本實驗室保藏;真菌誘導子有青霉菌(Penicillium italicum Wehmer)、番茄灰霉(Botrytis cinerea Pers.)、黃瓜炭疽病菌(Gloeosporium orbiculare Ars)、酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)由沈陽藥科大學微生物教研室張怡軒老師提供。斜面培養(yǎng)基(%)為馬鈴薯 20 g，蔗糖 2.0 g，瓊脂 2.0 g;改良培養(yǎng)基(%)為馬鈴薯20 g，蔗糖2.0 g，蛋白胨0.2 g;發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(%)為馬鈴薯4 g，KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，鹽酸噻胺 0.001 g，核黃素0.001 g，蔗糖 1 g。

1.2 方法

北蟲草菌種斜面培養(yǎng):用無菌環(huán)從保存的斜面菌種中掛取0.5 cm2菌種，轉(zhuǎn)接到新鮮斜面培養(yǎng)基中，放置培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度(25 ± 1)℃，光照強度 58.4 μmol/(m2·s)，光照時間 24 h/d，培養(yǎng)時間7 d。

北蟲草菌種液體培養(yǎng):在無菌條件下，用接種環(huán)在斜面培養(yǎng)基上刮去2 cm2的菌種，轉(zhuǎn)移至200 mL的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度(25 ±1)℃，光照強度 58.4 μmol/(m2·s)，光照時間 24 h/d，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min。

真菌系復壯:從保存的斜面菌種中刮取0.5 cm2母種，轉(zhuǎn)到新鮮的斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3代，繼代時間為5 d，培養(yǎng)溫度(25±1)℃。

真菌菌絲體培養(yǎng):將復壯的真菌2 cm2轉(zhuǎn)入200 mL改良培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度(25±1)℃，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，培養(yǎng)時間為7 d。

真菌誘導子制備:待真菌菌絲體充分生長后，將培養(yǎng)物在40℃烘至恒重，研磨后過80目篩，收集粉末加蒸餾水配成懸濁液，121℃，0.1 MPa滅菌 20 min，待用。

培養(yǎng)方法:在無菌條件下，將培養(yǎng)好的種子液按5%的接種量轉(zhuǎn)接到含有250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度(25±1)℃，光照強度 58.4 μmol/(m2·s)，光照時間 24 h/d，培養(yǎng)時間 7 d。考察各真菌誘導子對生長量和蟲草素產(chǎn)量的影響。

含量測定方法:采用反相高效液相色譜法測定蟲草素的含量。流動相為乙腈－水－甲醇(5∶90∶5，V∶V∶V)，檢測波長為260 nm，流速為 0.8 mL/min，柱溫 40 ℃。

菌絲體中蟲草素測定:精密稱取蟲草素菌絲體0.1 g，溶于5 mL 50%甲醇溶液中，超聲提取30 min，補足減失質(zhì)量，培養(yǎng)物先經(jīng)濾紙初濾，再經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，用微量進樣器精密吸取10 μL 濾液，進樣。

培養(yǎng)液中蟲草素測定:培養(yǎng)液10 mL在60℃蒸干至恒重，溶于5 mL 50%甲醇溶液中經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，取10 μL進樣。

菌絲體干重測定:取北蟲草液體培養(yǎng)物，在3 000 r/min條件下離心15 min，菌絲體在60℃烘至恒重，稱重。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲體干重、培養(yǎng)液和菌絲體蟲草素含量的變化情況

菌種接入到液體培養(yǎng)基后，菌體處于一種嶄新的生長環(huán)境中，此時菌體并不是立刻生長，1～2 d菌絲體生長緩慢，此時期為延遲期。之后，隨著時間的增加，菌絲體明顯增加，此為對數(shù)生長期。4～6 d菌絲體生長速度下降，為穩(wěn)定期，其中第5天菌絲體干重達到最大值為14.95 g/L。6～10 d菌絲體明顯減少，培養(yǎng)液變渾濁，由于營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，細胞發(fā)生自溶，這一階段為衰亡期。圖2顯示出北蟲草菌種在特定培養(yǎng)基中的生長規(guī)律，這為接種菌齡的選擇提供了依據(jù)。為了獲得菌絲體的最大值，應該在第5天進行測量。起初1～2 d蟲草素產(chǎn)量在一個很低水平，2～5 d伴隨菌絲體的生長而不斷增加(圖3)。起初營養(yǎng)物質(zhì)主要用于菌絲體的生長;穩(wěn)定期營養(yǎng)物質(zhì)主要用于蟲草素的合成;哀亡期細胞內(nèi)的蟲草素進入到培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中蟲草素的含量略微增加。

圖2 菌絲體隨時間變化趨勢圖

圖3 蟲草素含量隨時間變化趨勢圖

2.2 不同種類、濃度的真菌誘導子對菌絲體干重的影響

比較不同種類和不同濃度的真菌誘導子對北蟲草發(fā)酵培養(yǎng)物菌絲體干重、蟲草素產(chǎn)量變化的影響，將未添加真菌誘導子的北蟲草發(fā)酵物中菌絲體干重作為空白對照。結(jié)果見表1?？梢?，青霉菌、黃瓜炭疽和酵母菌對北蟲草生長有抑制作用;酵母菌對菌絲體干重產(chǎn)量無明顯作用;只有番茄灰霉能促進北蟲草菌絲體的生長，對菌絲體干重的增幅在1.06～1.16倍，其中以0.02%番茄灰霉效果較好。對于菌絲體，加入番茄灰霉均能提高蟲草素的產(chǎn)量，其中以0.02%番茄灰霉最顯著;培養(yǎng)液中蟲草素的含量，0.02%番茄灰霉是對照組的5.02倍，0.01%和0.05%番茄灰霉分別是對照組的3.73倍和3.11倍。酵母菌對蟲草素的產(chǎn)量無明顯作用。其他兩種真菌誘導子均不同程度地抑制蟲草素的產(chǎn)生。

表1 不同種類濃度的真菌誘導子對菌絲體干重和蟲草素產(chǎn)量的影響

2.3 0.02%番茄灰霉對北蟲草發(fā)酵培養(yǎng)的影響

由圖4和圖5可見，添加0.02%番茄灰霉誘導子的北蟲草菌絲體的干重和蟲草素含量較對照組都有明顯的增加，菌絲體干重在第7天達到最大值17.45 g/L，菌絲體中蟲草素含量在第7天達最大值0.798 mg/L，培養(yǎng)液中蟲草素的含量為198.59 mg/L。誘導子的加入，延長了北蟲草菌種的對數(shù)生長期，增加了生物量的積累的時間，使得菌絲體的干重和蟲草素含量顯著提高。

圖4 0.02%番茄灰霉對北蟲草菌絲體干重的影響

圖5 0.02%番茄灰霉對蟲草素含量的影響

3 討論

將真菌誘導子應用于北蟲草菌的發(fā)酵培養(yǎng)，以提高次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，具有一定的理論依據(jù)和現(xiàn)實意義。植物細胞與真菌細胞具有一定的同源性，二者在長期的進化中都具備了較完善的防御體系，都可通過調(diào)整自身代謝途徑及強度對抗外界的各種不良刺激。本研究選擇的4種真菌均為常見菌，其中黃瓜炭疽和番茄灰霉是為常見的植物致病菌，而青霉菌和酵母菌是自然界存在最廣泛的真菌品種。四者都存在于北蟲草的自然生存環(huán)境中，都有在自然條件下與北蟲草接觸并使北蟲草發(fā)生防御反應的可能。因此，北蟲草長期與這些真菌的接觸，可能產(chǎn)生特定的防御反應而改變其代謝途徑，產(chǎn)生大量具有活性的次生代謝產(chǎn)物，如蟲草素等。本研究證實，不同濃度的番茄灰霉確實能促進北蟲草對蟲草素的合成，尤其是0.02%的番茄灰霉對培養(yǎng)物中蟲草素產(chǎn)量的積累具有很好的促進作用。

本研究還對同種真菌誘導子的加入量作了初步考察。一般來說，真菌誘導子既含有活性成分，又含有拮抗成分。兩者相互制約，當加入量小時，拮抗作用小，但誘導作用也小，誘導效果不是最好;當加入量多時，誘導作用增大，但拮抗作用也隨著增大，效果也不好;只有加入量達到一個最適點，才能產(chǎn)生最好的誘導效果。這就要求對誘導子的加入量有一定的要求。本研究考察了4種真菌誘導子在0.01%，0.02%，0.05%濃度時對北蟲草的發(fā)酵物中菌絲體干重和蟲草素產(chǎn)量的影響，篩選出了一種起著正向誘導作用的誘導子，即番茄灰霉誘導子，但其作用機制還有待進一步探討。

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