成光宇 王 尚

1 吉林省長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院（130021）

2 吉林省長春中醫(yī)藥大學(xué)（130117）

源自《傷寒論》的生姜瀉心湯，具有和胃降逆、散水消痞之功效。后世醫(yī)家根據(jù)嘔吐為胃失和降所致，把生姜瀉心湯用于治療各種病證而見嘔吐者，如應(yīng)用于神經(jīng)性嘔吐、胃扭轉(zhuǎn)、胃癌、胃炎、胰腺炎及因放射治療所致嘔吐和化學(xué)治療引起的嘔吐等，均獲良效[1]。本實驗以藥物致嘔小鼠為模型，探討其止嘔原理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

ICR小鼠48只，體質(zhì)量18～22g，雌雄各半，吉林大學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.2 主要藥品及試劑

生姜瀉心湯水煎液:制成1g/1mL，置于4℃冰箱保存，臨用時按所需濃度配制，吉林省中醫(yī)院制劑室提供。所有藥材均經(jīng)過鑒定為正品后入藥。5-HT、DA 標(biāo)準(zhǔn)液（Sigma 公司產(chǎn)品）。EGF放免藥盒（北京北方生物技術(shù)研究所）。SP免疫組織化學(xué)檢測試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所）。

1.1.3 主要設(shè)備

LD200-2型電子秤（北京長拓銳新科技發(fā)展有限公司）；EHSY Lab勻漿器（西域集團(tuán)）；5424離心機（德國eppendorf）BP211D電子天平（德國賽多司）；FluoroMate FS-2熒光分光光度計（長春博邦科貿(mào)有限公司）；PowerTome-XL超薄切片機（上海育豐國際貿(mào)易有限公司）；M331579γ放射免疫計數(shù)器（北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥

將48只ICR小鼠隨機分為4組，即空白對照組、造模組、生姜瀉心湯組、格拉司瓊組。適應(yīng)喂養(yǎng)1周后，分別給模型組、生姜瀉心湯組、格拉司瓊組小鼠尾靜脈注射順鉑0.004mL/g。正常對照組予生理鹽水0.02mL/g，生姜瀉心湯組給予濃度為100%的生姜瀉心湯煎劑0.02mL/g，陽性對照組予格拉司瓊0.02mL/g，造模組予生理鹽水0.02mL/g，連續(xù)給藥14d。第14天給藥后禁食24h，自由飲水。于第15天處死動物并取材。

1.2.2 取材及實驗方法

1.2.2.1 參照王氏法[2]，將小鼠斷頭，迅速收集動脈血，并取腦組織，除去血膜，迅速剝?nèi)∪X，去除小腦后將腦組織稱重。專置于含有少量冰冷的酸化正丁醇的勻漿器中，在冰水浴中制成勻漿，將勻漿全部轉(zhuǎn)移至具塞刻度離心管內(nèi)，并用酸化正丁醇補充到4.0ml。經(jīng)機械振蕩5min （120次/min），離心5min （3000轉(zhuǎn)/min），取上清液2.5mL放入另一帶塞離心管中，加正庚烷5.0mL和0.1mol/L鹽酸1.2mL，振蕩5min，離心5min，此時溶液分為上下兩層。從上述水相層中，分別吸取0.5mL于2支小試管中，作測定5-HT、DA用。

1.2.2.2 解剖小鼠，找到胃竇部組織，剪下并沿胃大彎剪開胃竇組織，用生理鹽水沖洗內(nèi)容物至干凈，放進(jìn)10%中性福爾馬林溶液中固定標(biāo)本。選取每組中的胃竇組織標(biāo)本，逐級酒精脫水，二甲苯透明、浸臘，石蠟包埋，常規(guī)切片4μm，HE染色。

1.2.2.3 放射免疫法檢測EGF

指標(biāo)檢測嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1.2.2.4 免疫組織化學(xué)法測定PCNA

PCNA免疫組織化學(xué)染色采用SP法，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，PBS代替一抗體作陰性對照。

1.2.3 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS13.0 for Windows統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（±s），組間差異采用t檢驗，P＜0.05說明有差異。

2 結(jié) 果

2.1 生姜瀉心湯對順鉑所致小鼠腦組織5-HT、DA 改變的影響

由表1可見，①化療用藥后小鼠腦組織內(nèi)5-HT、DA 含量明顯提高，與空白對照組比較P＜0.01；②生姜瀉心湯組小鼠腦組織內(nèi)5-HT、DA 含量顯著低于造模組，P＜ 0.01；③生姜瀉心湯組與格拉司瓊組比較，在DA 方面優(yōu)于格拉司瓊，P＜0.01；在5-HT方面與之相當(dāng)，P＞ 0.05。

表1 各組小鼠腦組織5-HT、DA改變的比較（單位μg/mg ，±s)

表1 各組小鼠腦組織5-HT、DA改變的比較（單位μg/mg ，±s)

生姜瀉心湯組與空白對照組比較：**P＜0.01；與造模組比較：△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 n DA 5-HT空白對照組 12 0.56±0.05 0.66±0.04造模組 12 0.92±0.03** 0.87±0.03**生姜瀉心湯組 12 0.67±0.07 0.73±0.11格拉司瓊組 12 0.79±0.03 0.78±0.07

2.2 HE染色病理結(jié)果

胃腸黏膜損傷以模型組最明顯，黏膜層變薄、萎縮、壞死，淋巴浸潤，色蒼白，皺襞變平或走向紊亂，有者黏膜表面有黃染黏液被覆；空白組黏膜呈粉紅色，有光澤，被覆較多黏液，黏膜皺襞表面光滑，走向規(guī)則；生姜瀉心湯組和格拉司瓊組胃腸黏膜損傷較小，并且有新的組織生成，說明其胃腸組織在修復(fù)。

表2 各組EGF含量變化的比較 (單位ng/L，±s)

表2 各組EGF含量變化的比較 (單位ng/L，±s)

注：生姜瀉心湯組與其他3組比較：*P＜0.05，*P＜0.01

組別 n EGF空白對照組 12 0.55±0.07造模組 12 0.38±0.04**生姜瀉心湯組 12 0.49±0.06格拉司瓊組 12 0.43±0.09

2.3 放射免疫法檢測EGF的結(jié)果EGF含量

由表2可見，在用化療藥的3組動物中，以生姜瀉心湯組EGF含量最高，與造模組相比有顯著性差異，P＜0.05、P＜0.01；與格拉司瓊組比較無顯著性差異；與空白組比較無顯著性差異。格拉司瓊組與其他3組比較均無差異。

2.4 免疫組織化學(xué)法測定PCNA的結(jié)果

PCNA以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)明顯的棕褐色顆粒為陽性。每張圖片選取陽性細(xì)胞最密集處，用高倍鏡（40×）計數(shù)200個細(xì)胞，算出陽性細(xì)胞百分率。由表3可見，在用化療藥的3組動物中，以生姜瀉心湯組PCNA的陽性表達(dá)率最高，陽性率與造模組相比有顯著性差異，P＜0.05、P＜0.01；生姜瀉心湯組PCNA陽性表達(dá)率與空白組差異無顯著性；生姜瀉心湯組與格拉司瓊組相比有差異，P＜0.05。造模組與格拉司瓊組PCNA陽性表達(dá)率有明顯的差異P＜0.05、P＜0.01。

表3 各組PCNA陽性率表達(dá)情況的比較(單位%，±s)

表3 各組PCNA陽性率表達(dá)情況的比較(單位%，±s)

注：生姜瀉心湯組與其他3組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；格拉司瓊組與其他3組比較：△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 n PCNA陽性率空白對照組 12 35.9±3.66造模組 12 20.6±3.48 **△△生姜瀉心湯組 12 36.1±3.46△格拉司瓊組 12 30.8±3.18*

3 討 論

順鉑在臨床上已被公認(rèn)為傳統(tǒng)的致嘔藥物，其在神經(jīng)遞質(zhì)方面致嘔作用的機制，主要是引起外周及中樞神經(jīng)5-HT、DA 神經(jīng)遞質(zhì)的升高，使迷走神經(jīng)興奮而產(chǎn)生嘔吐反射。神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、DA 在化療中起著十分關(guān)鍵的作用。現(xiàn)臨床上常用的對抗化療嘔吐的藥物便主要是5-HT受體阻斷劑及DA受體阻斷劑，因此本實驗選用5-HT、DA為觀察指標(biāo)。同時，通過觀察順鉑對胃腸組織的損傷程度及恢復(fù)情況，可以通過檢測EGF的含量及PCNA的陽性表達(dá)率來判斷。

生姜瀉心湯對順鉑所致小鼠腦組織內(nèi)5-HT、DA改變的影響實驗結(jié)果顯示，生姜瀉心湯組與格拉司瓊組比較，在DA方面優(yōu)于格拉司瓊，P＜0.01；在5-HT方面與之相當(dāng)，P＞0.05。說明小半夏湯有明顯對抗順鉑導(dǎo)致小鼠腦組織5-HT、DA含量分泌增高的作用，且作用效果優(yōu)于格拉司瓊。由此可推斷生姜瀉心湯對抗化療藥物順鉑所致嘔吐的作用機制主要是影響5-HT、DA分泌而起作用。EGF存在于頜下腺、十二指腸腺和胰腺中，是一種多效生長因子，它的主要功能是促進(jìn)細(xì)胞增生，參與胃腸上皮細(xì)胞的增生、成熟、分化，在生理條件下調(diào)節(jié)胃腸道的生長發(fā)育，還具有營養(yǎng)和保護(hù)胃腸道的作用。EGF也是反映胃腸組織修復(fù)的可靠指標(biāo)之一。本實驗結(jié)果表明，生姜瀉心湯能使EGF的含量提高，EGF可促進(jìn)胃腸上皮細(xì)胞生長繁殖，對胃腸黏膜有一定的修復(fù)作用。與造模組比較，有著明顯的統(tǒng)計學(xué)意義。增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）是一種酸性核蛋白（相對分子質(zhì)量3600），為DNA多聚酶的一種輔助蛋白，直接參與DNA的合成，僅在增殖的細(xì)胞中合成與表達(dá)。因此PCNA常作為測定組織細(xì)胞增殖水平的指標(biāo)之一，具有實用性和可行性。本實驗結(jié)果表明，生姜瀉心湯能提高PCNA的陽性表達(dá)率，與造模組比較，具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義。

[1]閆兆平,黃文甫,衛(wèi)向陽等.生姜瀉心湯治療反流性食管炎的臨床觀察[J].華西醫(yī)學(xué),2010,23(5):840-841.

[2]麻春杰.半夏瀉心湯對實驗性大鼠胃運動的影響[J].實用中醫(yī)藥雜志,1996,12(4):31.