徐貴江 張 明 任麗偉 洪菊生 李國慶

1 揚州市婦幼保健醫(yī)院（225002）

2 揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（225002）

目前，基因療法在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域掀起了研究熱潮。然而，實施基因治療的前提是將功能基因?qū)胄枰邮苤委煹陌衅鞴倩虬薪M織的細胞中，讓功能基因表達產(chǎn)生能夠消除或減輕疾病癥狀的物質(zhì)。

對此，基因轉(zhuǎn)染研究就顯得尤為重要?；蜣D(zhuǎn)染方法眾多，如磷酸鈣法、電穿孔法、陽離子脂質(zhì)體法、病毒介導(dǎo)法和顯微注射法等。不同的轉(zhuǎn)染方法、不同的細胞系轉(zhuǎn)染效率不盡相同。本研究采用EGFP報告基因轉(zhuǎn)染AAV-293、NIH-3T3、CEF 3種細胞，旨在比較3種細胞用于基因轉(zhuǎn)染時效率的高低。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

E.coliDH5a菌株、pEGFP-C1質(zhì)粒、雞胚成纖維細胞（CEF）均由揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院分子實驗室提供；AAV-293和NIH-3T3細胞株為作者醫(yī)院保存。

1.2 主要儀器和設(shè)備

超凈臺；CO2培養(yǎng)箱；熒光倒置顯微鏡；電子天平；離心機；水浴鍋，電熱恒溫板等。

1.3 主要試劑

高糖DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶、聚乙烯亞胺（PEI）購自 Sigma公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自（大連）Takara 公司。

1.4 質(zhì)粒的小量抽提

將含有質(zhì)粒pEGFP-N1的E.coliDH5а培養(yǎng)過夜，次日使用質(zhì)粒小量抽提試劑盒抽提質(zhì)粒pEGFP-N1。

1.5 質(zhì)粒的純化與消毒

將抽提的質(zhì)粒pEGFP-N1進行去內(nèi)毒素純化處理，用2倍體積的無水乙醇沉淀提取質(zhì)粒，具體方法步驟見參考文獻[1]。75%乙醇洗滌質(zhì)粒沉淀進行滅菌處理，在無菌條件下晾干后，溶解于5%葡萄糖溶液中。

1.6 質(zhì)粒的濃度及純度測定

使用核酸濃度及純度分析儀測定純化的質(zhì)粒pEGFP-N1。

1.7 PEI介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞

將AAV-293、NIH-3T3、CEF 3種細胞在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，待生長至90%匯合度時，用0.25%胰蛋白酶溶液消化分散細胞，將分散的細胞懸液接種于6孔細胞培養(yǎng)板，濃度為1×105個細胞/孔，然后于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細胞生長至80% 匯合度時，吸除細胞培養(yǎng)液，細胞用預(yù)熱至37℃的PBS緩沖液洗滌3次后，將PEI包裹的純化好的質(zhì)粒pEGFP-N1加入每板孔中，于CO2培養(yǎng)箱中孵育3h后，改換含10%FBS的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，觀察結(jié)果。

1.8 轉(zhuǎn)染效率的評定

轉(zhuǎn)染48h后，在熒光倒置顯微鏡下觀察EGFP在細胞的表達，分析轉(zhuǎn)染效率。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒的濃度及純度測定

核酸濃度及純度測定結(jié)果表明，純化后質(zhì)粒pEGFP-N1的濃度約為1μg/μL，且OD260/280=1.83說明質(zhì)粒的純度很好，可以用來轉(zhuǎn)染細胞。

2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞的觀察結(jié)果

轉(zhuǎn)染48h后，于熒光倒置顯微鏡下觀察，結(jié)果表明，EGFP基因轉(zhuǎn)染AAV-293、NIH-3T3、CEF 3種細胞后，都可觀察到綠色熒光（圖1）。

2.3 評定轉(zhuǎn)染效率

通過觀察分析熒光強度及綠色熒光細胞數(shù)，比較轉(zhuǎn)染效率表明，EGFP基因在NIH-3T3細胞中的轉(zhuǎn)染效率最高，其次是AAV-293細胞，CEF細胞中較低。

3 討 論

本研究采用的是陽離子聚合物聚乙烯亞胺（PEI）介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的方法[2]。PEI的相對分子量為25×103，是一種有機高分子聚合物，具有較高的陽離子電荷密度，能形成高度分枝，每相隔二個碳個原子，即：每第3個原子都是質(zhì)子化的氨基氮原子，使得聚合物網(wǎng)絡(luò)在任何pH下都能充當(dāng)有效的“質(zhì)子海綿”體，從而將DNA 網(wǎng)于其中，這種多聚陽離子能將各種基因轉(zhuǎn)入各種種屬細胞，其轉(zhuǎn)染效果好，而且細胞毒性低[3,4]。因此PEI 作為DNA的轉(zhuǎn)染劑可有效用于體內(nèi)和體外的基因轉(zhuǎn)染。

本研究采用增強型綠色熒光蛋白[5-9]（EGFP）基因轉(zhuǎn)染細胞。在評定轉(zhuǎn)染效率時，只需用肉眼在熒光顯微鏡下通過分析熒光強度及熒光細胞數(shù)目就可直觀地判定轉(zhuǎn)染效率的高低。

圖1 pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞AAV-293、NIH-3T3、CEF

近些年來基因治療有成功的案例，但更多的是在總結(jié)教訓(xùn)，是一個喜憂參半的全新領(lǐng)域?；虔煼ㄊ〉母驹蛟谟?，功能基因在需要接受治療的靶器官或靶組織的細胞中轉(zhuǎn)染效率不高，絕大多數(shù)基因尚未表達產(chǎn)物時，就被機體清除。本研究表明，在實施基因治療時，不妨先看看功能基因在靶細胞上的轉(zhuǎn)染效率，以為后期基因治療的成功奠定基礎(chǔ)。

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