羅海燕 宋姍姍 黃暨生 孫冬梅 劉素香 鄺棗園*

廣東省廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（510006）

人體體表、與外界相通的腔道內(nèi)存在大量并不致病的微生物群，尤其是腸道內(nèi)更是寄居著種類繁多的微生物，這些微生物統(tǒng)稱為腸道菌群。這些微生物群對其宿主非但無害，而且有益，具有促進(jìn)營養(yǎng)吸收、抗衰老、抗腫瘤等眾多的生理效應(yīng)，這是正常微生物群與其宿主長期共生的進(jìn)化結(jié)果。

根據(jù)中醫(yī)理論，過量或長期服用苦寒的清熱解毒的中藥將損傷脾胃、耗傷正氣，提出苦寒傷胃理論，邱賽紅等[1]從胃腸運(yùn)動、肝腎功能和胃腸激素[2]等角度研究了多種苦寒中藥的傷胃內(nèi)涵。本課題組自2007年開始從腸道微生態(tài)角度研究苦寒藥的傷胃機(jī)制，我們的研究發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯在一定濃度下可抑制雙歧桿菌和乳酸桿菌的生長，顯示一定的抑制益生菌的作用的不良現(xiàn)象。同時，在較低濃度時尚可抑制條件致病菌的生長[3]。而從清熱解毒藥提取的有效成分是否也具有“傷胃”作用則未見報道。

故本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，觀察了黃芩苷對腸道四種菌的影響，同時欲觀察其濃度和作用時間對腸道細(xì)菌的影響規(guī)律，以期為臨床合理使用黃芩苷提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22g，由廣東省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物合格證號：SCXK（粵）2008-0002；實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證號：粵監(jiān)證字2008A022。

表1 黃芩苷對小鼠體質(zhì)量的影響（±s）

表1 黃芩苷對小鼠體質(zhì)量的影響（±s）

注：※與正常組比較，其中※表示P＜0.05，※※表示P＜0.01

組別 N 第1天 第3天 第6天 第9天 第14天正常組 8 21.38±0.86 24.10±0.55 25.04±0.35 27.65±0.97 29.99±0.73抗生素組 8 20.55±0.87 23.70±0.67 24.53±0.61 25.41±0.93※※ 26.64±1.30※※黃芩苷低劑量 8 20.81±1.14 23.95±1.02 25.20±0.81 27.89±0.88 30.16±0.94黃芩苷中劑量 8 21.11±0.69 23.59±0.64 24.51±0.47 26.24±0.42※ 29.41±0.69黃芩苷高劑量 8 20.91±1.28 23.30±1.13 24.36±0.97 25.49±1.13※※ 27.65±1.04※※

表2 不同處理因素下四種細(xì)菌數(shù)量變化（±s，N=8）

表2 不同處理因素下四種細(xì)菌數(shù)量變化（±s，N=8）

注：※與正常組比較，其中※表示P＜0.05，※※表示P＜0.01

分組 3天 6天 9天 14天大腸埃希菌正常組 8.25±0.27 8.16±0.30 8.19±0.07 8.18±0.85林可霉素組 8.43±0.47 8.62±0.59 8.83±0.24※ 9.39±0.16※※黃芩苷低劑量 8.13±0.58 9.39±0.31※※ 9.00±0.44※※ 9.40±0.21※※黃芩苷中劑量 8.35±0.54 7.77±0.50 7.95±0.62 9.10±0.17※※黃芩苷高劑量 9.14±0.72※ 8.87±0.56 9.14±0.20※※ 9.04±0.43※※糞腸球菌正常組 8.48±0.21 8.10±0.52 8.44±0.79 8.45±0.42林可霉素組 8.29±0.61 9.17±0.27 9.50±0.17※※ 9.65±0.14※※黃芩苷低劑量 8.26±0.26 8.56±0.76 7.85±0.16※ 8.18±0.52黃芩苷中劑量 7.44±0.28※※ 6.77±0.49※※ 8.19±0.41 7.73±0.43※※黃芩苷高劑量 7.61±0.34※※ 7.99±0.73 8.61±0.43 9.12±0.30※雙歧桿菌正常組 9.31±0.14 9.26±0.78 9.36±0.08 9.35±0.67林可霉素組 9.04±0.42 8.96±0.31 8.93±0.20※ 8.61±0.29※※黃芩苷低劑量 9.06±0.32 9.23±0.53 9.33±0.15 9.42±0.16黃芩苷中劑量 9.02±0.21 9.26±0.20 9.12±0.27 9.40±0.29黃芩苷高劑量 9.38±0.24 8.96±0.35 8.88±0.36※※ 8.87±0.23※※正常組 9.29±0.22 9.21±0.25 9.25±0.57 9.32±0.36林可霉素組 8.91±0.32 8.72±0.26※ 8.63±0.45※ 8.30±0.55※※黃芩苷低劑量 8.80±0.39 9.25±0.28 9.21±0.13 9.41±0.33黃芩苷中劑量 9.22±0.43 9.30±0.20 8.97±0.11 9.22±0.23黃芩苷高劑量 9.45±0.23 8.69±0.55※※ 8.95±0.13 8.73±0.29※乳酸桿菌

1.1.2 藥物與試劑

鹽酸林可霉素注射液（上?，F(xiàn)代哈森藥業(yè)有限公司，2mL/支，300mg/mL，國藥準(zhǔn)字H41021941）、黃芩苷（純度＞98%，南京青澤醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRSA培養(yǎng)基、BS培養(yǎng)基、糞腸球菌瓊脂、麥康凱培養(yǎng)基、BHI培養(yǎng)基，由青島高科園海博生物技術(shù)有限公司出品。

1.1.4 主要設(shè)備

YXQ-LS-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器、超凈工作臺、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、AE1-160電子天平、PV-1漩渦混勻器、金花加樣器、PYX-DHS-50×65-BS-Ⅱ隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、825-A型厭氧菌培養(yǎng)罐、BX51型熒光明場數(shù)碼顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥

取昆明種小鼠，隨機(jī)分為5組：正常組、抗生素組、黃芩苷高劑量組、黃芩苷中劑量組和黃芩苷低劑量組?？股亟M，給予鹽酸林可霉素灌胃，120mg/d；黃芩苷高劑量組給予黃芩苷灌胃，100mg/（kg·d）；黃芩苷中劑量組給予黃芩苷灌胃，50mg/（kg·d）；黃芩苷低劑量組給與黃芩苷灌胃，25mg/（kg·d），正常組給予生理鹽水灌胃，0.4mL/d。每晚8時后禁食，次日9時灌胃后供給足量飼料。

1.2.2 形態(tài)行為觀察

每天觀察和記錄各組小鼠外形、活動、飲食、排便情況，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行第1、3、6、9、14天稱量和記錄小鼠體質(zhì)量。

1.2.3 腸道菌群分析

每組于第3、6、9、14天取8只將小鼠斷椎處死，常規(guī)消毒后正中剪開腹腔，找出回盲部，無菌手法取出盲腸內(nèi)容物涂于潔凈玻片上，革蘭染色后鏡檢計數(shù)球菌和桿菌的比例，另取盲腸內(nèi)容物0.1g，置于裝有玻璃珠的無菌試管內(nèi)，加0.9mL生理鹽水，于震蕩器上震蕩15min，使盲腸內(nèi)容物均質(zhì)化。將上述震蕩好的標(biāo)本進(jìn)行10倍系列稀釋至106。選用10-4、10-5、10-6，以滅菌吸頭，自高稀釋度向低稀釋度在相應(yīng)的培養(yǎng)基上各滴加50μL稀釋液，待滴種好的培養(yǎng)基吸干后，放入37℃ 溫箱中培養(yǎng)。其中MRSA培養(yǎng)基（分離乳酸桿菌）厭氧培養(yǎng)48h，BS 培養(yǎng)基（分離雙歧桿菌）厭氧培養(yǎng)72h、腸球菌瓊脂（分離腸球菌）需氧培養(yǎng)24h、麥康凱培養(yǎng)基（分離腸桿菌）需氧培養(yǎng)24h。待菌落長出后，以菌落形態(tài)、革蘭染色、生化反應(yīng)鑒定所需目的菌。培養(yǎng)好的細(xì)菌經(jīng)鑒定后計算每克盲腸內(nèi)容物中的細(xì)菌數(shù)量，即CFU/g標(biāo)本。選擇菌落適中的稀釋度，算出同一稀釋度平均菌落數(shù)（X）。

公式：CFU/g標(biāo)本=X/0.05×稀釋倍數(shù)×1/標(biāo)本重量（g）。結(jié)果用常用對數(shù)值1gCFU/g表示。

2 結(jié) 果

2.1 各組表征變化

正常組小鼠飲食正常，行動活躍，被毛平整光滑，糞便正常。抗生素組小鼠隨著實(shí)驗(yàn)時間增加，攝食量下降，精神萎靡，行動遲緩，被毛無光澤，畏寒扎堆，大便稀濕等表現(xiàn)越來越明顯。高劑量黃芩苷組小鼠攝食量亦下降，行動較遲緩，被毛無光澤，大便稀濕，隨著實(shí)驗(yàn)時間增加，和抗生素組小鼠表征相似。中劑量黃芩苷組，3、6d時和正常組小鼠表征接近，九天組時開始出現(xiàn)攝食量稍下降，行動較遲緩，糞便較稀釋等現(xiàn)象，但變化沒有高劑量黃芩苷組明顯。低劑量黃芩苷組隨著實(shí)驗(yàn)時間的增加小鼠表征無明顯變化，飲食正常，行動活躍，被毛平整光滑，糞便正常。

2.2 體質(zhì)量變化

抗生素組，高劑量黃芩苷組小鼠體質(zhì)量增長緩慢，于第9天和第14天時該兩組小鼠體質(zhì)量均小于正常組，差別有顯著意義（P＜0.01）。低劑量黃芩苷組小鼠體質(zhì)量和正常組比較，在第9天時體質(zhì)量少，第14天時和正常組比較無差異，見表1。

2.3 腸道菌群變化

我們分別觀察了4種菌4個時間點(diǎn)的情況，見表2，現(xiàn)分述如下：

2.3.1 大腸桿菌

抗生素組第9、14天出現(xiàn)大腸桿菌升高，4個時間點(diǎn)呈上升趨勢；黃芩苷高劑量第3天開始出現(xiàn)大腸桿菌升高；黃芩苷中劑量第14天大腸桿菌升高；黃芩苷低劑量組第6天開始出現(xiàn)大腸桿菌升高，黃芩苷各組4個間點(diǎn)變化均波動，無明顯上升或降低趨勢，見表2。

2.3.2 糞腸球菌

抗生素組第9、14天出現(xiàn)腸球菌升高，4個間點(diǎn)呈上升趨勢；黃芩苷高劑量第3天開始腸球菌降低，4個間點(diǎn)出現(xiàn)先降后升趨勢，中劑量和低劑量黃芩苷組腸球菌減少，4個間點(diǎn)也是先降后升。

2.3.3 雙歧桿菌

抗生素組第9、14天出現(xiàn)下降，4個間點(diǎn)呈明顯下降趨勢；黃芩苷高劑量組也在第9、14天雙歧桿菌下降，4個間點(diǎn)呈明顯下降趨勢；黃芩苷中、低劑量組雙歧桿菌與正常組比較差別無統(tǒng)計學(xué)意義，4個間點(diǎn)呈波動。

2.3.4 乳酸桿菌

抗生素組第9、14天出現(xiàn)乳酸桿菌下降；黃芩苷高劑量第6天出現(xiàn)乳酸桿菌下降，4個間點(diǎn)波動；中、低劑量黃芩苷對乳酸桿菌無影響，4個間點(diǎn)變化波動。

綜上所述，我們可以看到林可霉素對各種菌的影響變化比較有規(guī)律，均在第9和14天出現(xiàn)變化，出現(xiàn)乳酸桿菌和雙歧桿菌減少，大腸桿菌和腸球菌增加，4個間點(diǎn)的變化規(guī)律也較明顯，大腸桿菌和腸球菌呈上升趨勢，乳酸桿菌和雙歧桿菌呈下降趨勢。黃芩苷對各種菌的影響變化則較復(fù)雜，出現(xiàn)變化的時間點(diǎn)有些提前到第3天，有些推遲到第14天，中、低劑量黃芩苷對乳酸桿菌和雙歧桿菌無影響，但可升高大腸桿菌含量，降低糞腸球菌含量，高劑量黃芩苷可降低雙歧桿菌和乳酸桿菌含量，升高大腸桿菌，降低糞腸球菌。黃芩苷對腸球菌的影響與林可霉素恰好相反。

4個間點(diǎn)的變化除腸球菌出現(xiàn)先降后升外，其他各組均較波動，無明顯的上升或下降趨勢。

3 討 論

本研究顯示林可霉素造成的菌群失調(diào)，主要出現(xiàn)在用藥的第9和14天，出現(xiàn)益生菌乳酸桿菌和雙歧桿菌的下降，大腸桿菌和腸球菌的升高，出現(xiàn)了典型的菌群失調(diào)現(xiàn)象，且菌群的變化有明顯的量-時規(guī)律，說明該藥可以作為良好的菌群失調(diào)模型和對照。

黃芩苷高劑量組也出現(xiàn)益生菌的減少，說明清熱解毒藥黃芩的提取物在一定濃度也會造成菌群失調(diào)，其出現(xiàn)菌群失調(diào)的時間與林可霉素類似，提示臨床使用該藥劑量和用量的選擇需慎重，也說明黃芩苷可能是黃芩造成菌群失調(diào)的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

有趣的研究結(jié)果是，與黃連解毒湯的研究[3]類似，我們也觀察到黃芩苷在中、低劑量使用時出現(xiàn)條件致病菌糞腸球菌的減少，這點(diǎn)與林可霉素不一致（林可霉素可使糞腸球菌升高）。腸球菌屬目前被認(rèn)為是醫(yī)院感染的常見致病菌，通常引起尿道感染、傷口感染、菌血癥等，主要見于免疫力低下或過量使用抗生素的患者[4]，也可導(dǎo)致敗血癥、心內(nèi)膜炎等危及生命，病死率達(dá)21.0%～27.5%[5]。腸球菌種類很多，其中糞腸球菌最為常見。本研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的黃芩苷可抑制糞腸球菌的生長，提示黃芩苷可能在治療糞腸球菌感染中起到一定作用。

[1]邱賽紅,李飛艷,尹健康等.9味苦寒藥對小鼠胃腸運(yùn)動與肝腎功能影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2004,24(5)：1-6.

[2]李飛艷,邱賽紅,尹健康等.常用苦寒藥對大鼠胃腸激素影響的研究[J].湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2007,27(1)：9-11.

[3]羅海華,董姝,張晟等.黃連解毒湯對小鼠腸道菌群的影響[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2009,9(4)：367-371.

[4]Olesen HV,Moller JK.Enterococcal infection： clinical findings and treatment considering antibiotic resistance in Denmar[J].Ugeskr Laeger,2002,163(18)：2386-2390.

[5]Sanchez-silos RM,Perez-Giraldo C.Pathogenicity of enterococcus spp. Characteristics of 169 hospital isolates[J].Enferm Infection Microbiol Clin,2000,18(4)：165-169.