余闐 卿茂盛 肖偉

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種慢性自身免疫性的炎癥性關(guān)節(jié)病，其病理基礎(chǔ)為關(guān)節(jié)滑膜炎，后期致滑膜增厚，骨與軟骨組織受損。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的關(guān)節(jié)軟骨和骨組織損害，與滑膜細胞的過度增生活化與凋亡不足密切相關(guān)[1]。研究表明，RA患者滑膜組織和成纖維樣滑膜細胞中Fas／FasL減少或突變、細胞因子和Bcl-2表達增加、p53突變等，從而導(dǎo)致炎癥細胞及滑膜細胞凋亡不足，表現(xiàn)為抑制凋亡和誘導(dǎo)凋亡免疫穩(wěn)態(tài)失衡的病理改變[2]。

桂枝芍藥知母湯始見于張仲景《金匱要略·中風(fēng)歷節(jié)病脈證并治第五》，歷代醫(yī)家均將其作為治療痹證的主方在臨床廣泛應(yīng)用。本研究試圖探討桂枝芍藥知母湯對RA大鼠滑膜細胞增殖、凋亡的影響及對細胞凋亡調(diào)控基因的影響。

1 材料與方法

1.1 體內(nèi)動物實驗

1.1.1 動物造模與分組 選取清潔級Wistar大鼠30只，體重50～100g，用0.1mmol/L醋酸溶解Ⅱ型膠原蛋白(2mg/mL，4℃，過夜)，再與等量的弗氏完全佐劑混合，于冰浴中充分乳化，除正常組外，每只大鼠尾根部皮下多點注射膠原蛋白0.2mg。造模后10d將動物隨機分為正常組、對照組和治療組各10只。

1.1.2 桂枝芍藥知母湯方藥 桂枝，白芍，炙甘草，麻黃，知母，白術(shù)，炮附子，生姜。

1.1.3 實驗方法

1.1.3.1 動物灌胃藥物及取材 將桂枝芍藥知母湯按常規(guī)方法煎煮濃縮成含生藥1kg/L，4℃保存?zhèn)溆谩Ｔ炷：蟮?0天治療組大鼠灌服桂枝芍藥知母湯制劑11g/(kg·d)，正常組灌服生理鹽水，每日一次；對照組每6天予灌服一次MTX混懸液5mg/kg。連續(xù)飼養(yǎng)36d，均斷頭處死。取膝關(guān)節(jié)滑膜組織，一部分用福爾馬林固定、包埋、切片，留待原位細胞凋亡檢測；另一部分經(jīng)Boin’s液固定1周后，組織脫水，常規(guī)石臘包埋、切片，留待細胞凋亡相關(guān)調(diào)控基因檢測。

1.1.3.2 檢測指標(biāo)

①普通光鏡觀察 HE染色觀察滑膜細胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察。

②透射電鏡觀察 滑膜細胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察。

③原位細胞凋亡檢測(堿性磷酸酶標(biāo)記法)。操作過程：a)脫臘(預(yù)加熱60℃)到PBS溶液，劃圈。b)0.1%檸檬酸鈉Trition孵育8min。c)PBS漂洗2min×2次。d)加紫色瓶50μL標(biāo)記混合物37℃孵育1h。e)PBS漂洗2min×2次。f)加黃蓋瓶中50μL轉(zhuǎn)換液37℃孵育30min。g)PBS漂洗3min×3次。h)加50μL顯色液顯色5～10min，PBS漂洗3次。g核快紅復(fù)染核一兩分鐘，PBS漂洗，水溶性封片劑直接封片，60℃烘干。陰性對照：只加標(biāo)記溶液代替核苷酸反應(yīng)液。

檢測細胞凋亡結(jié)果判定：在滑膜組織中，凋亡細胞呈深藍或青紫色，每張切片沿滑膜組織帶計算400倍視野中細胞的凋亡數(shù)，計數(shù)5～10個視野，標(biāo)出每個視野平均細胞凋亡數(shù)。

④細胞化學(xué)檢測細胞凋亡相關(guān)調(diào)控基因，SP法檢測Fas抗原、Bcl-2蛋白、p53蛋白。操作過程：a)室溫封閉20min，洗3次。b)將切片浸入0.01M枸椽酸緩沖液(pH6.0)、電爐加熱至沸騰2min后，間隔5min，反復(fù)1次，冷卻后PBS洗2次。c)滴加正常山羊血清封閉液，室溫封閉30min。d)滴加1∶100(10mL+1mL PBS)兔抗人Fas、Bcl-2-抗、P53-抗，4℃過夜，PBS洗2min×3次。e)滴加鏈霉素卵白素(SABC)，室溫下30min，PBS洗3次。f)DAB顯色20min。g)常規(guī)脫水、透明、封片。

1.2 體外實驗

1.2.1 建立RA動物模型 選取清潔級Wistar大鼠30只，體重50～100g，用0.1mmol/L醋酸溶解Ⅱ型膠原蛋白(2mg/mL，4℃過夜)，再與等量的弗氏完全佐劑混合，于冰浴中充分乳化，除正常組外，每只大鼠尾根部皮下多點注射膠原蛋白0.2mg。

1.2.2 動物分組、灌胃藥物及取材 造模后第10天將動物隨機分為正常組、對照組和治療組各10只，將桂枝芍藥知母湯按常規(guī)方法煎煮濃縮成含生藥1kg/L，4℃保存?zhèn)溆?。實驗組灌服桂枝芍藥知母湯制劑11g/(kg·d)，正常組、對照組灌服等量生理鹽水，每日一次，連續(xù)飼養(yǎng)36d，斷頭處死，仰位固定。于膝關(guān)節(jié)正中縱行切開皮膚，分離肌肉，露出膝蓋骨，繼續(xù)向下分離，可見平滑光亮的滑膜組織，用手術(shù)刀分離關(guān)節(jié)的滑膜層和纖維層，然后取出滑膜層組織，每一只大鼠可采集雙側(cè)滑膜組織約15～20mg。將滑膜組織作連續(xù)切片和HE染色進行鑒定，不應(yīng)含有軟骨細胞和骨骼肌細胞。

1.2.3 滑膜細胞的分離和培養(yǎng) 無菌操作取大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，剪成1mm3大小后加入4ml0.4mg/mL的Ⅱ型膠原酶(溶于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)，于37℃、5%CO2條件下孵育3h，離心收集未貼壁的細胞，將細胞重懸于含有15%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，用臺盼藍排斥試驗檢測基活力大于95%；分離的滑膜細胞經(jīng)涂片和Giemsa染色，高倍鏡下計數(shù)300個細胞，其純度為95%以上。

1.2.4 藥物血清的制備 將桂枝芍藥知母湯按常規(guī)方法煎煮濃縮成含生藥1kg/L，4℃保存?zhèn)溆?。清潔級Wistar大鼠10只，分為兩組，每組5只。實驗組灌服桂枝芍藥知母湯制劑11g/(kg·d)，對照組灌服等量生理鹽水，連續(xù)灌藥10d，于最后一次灌藥后2h腹主動脈放血，無菌分離血清，以56℃、30min滅活處理后，0.45μm微孔濾膜過濾除菌，-20℃凍存?zhèn)溆?。給藥劑量：在體試驗的給藥劑量可按體表面積直接計算法換算動物和人之間的劑量。實際每次給藥劑量=在體試驗的給藥劑量×反應(yīng)系統(tǒng)中被稀釋的倍數(shù)。

1.2.5 細胞分組并加入藥物血清 將細胞分為3組：空白對照、空白血清和中藥血清組。分別加入培養(yǎng)液、空白血清和中藥血清后繼續(xù)培養(yǎng)48h，然后進行效應(yīng)指標(biāo)檢測。實驗結(jié)果采用方差分析。

1.2.6 檢測指標(biāo) ①掃描電鏡，體外培養(yǎng)滑膜細胞經(jīng)藥物處理后的細胞形態(tài)學(xué)變化。②流式細胞儀，將培養(yǎng)的細胞懸液用酒精固定，PI染色后上機檢測細胞凋亡情況。③DNA凝膠電泳，檢測細胞凋亡。④細胞化學(xué)檢測細胞凋亡相關(guān)調(diào)控基因，SP法檢測Fas抗原、Bcl-2蛋白、p53蛋白。

2 結(jié)果

2.1 體內(nèi)實驗 見表1～3。

組織學(xué)改變①電鏡觀察:實驗組可見細胞體變圓、胞漿量減少、胞核不規(guī)則及核染色質(zhì)濃縮，胞膜完整，并可見凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)改變。②流式細胞儀檢測結(jié)果:凋亡細胞增加幅度實驗組最明顯，實驗組與對照組及正常組增加幅度比較均有顯著性差異(P＜0.05)。

2.2 體外實驗 見表4～6。

組織學(xué)改變①電鏡觀察:可見細胞體變圓、胞漿量減少、胞核不規(guī)則及核染色質(zhì)濃縮，胞膜完整，并可見凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)改變。②流式細胞儀檢測結(jié)果:加藥后凋亡細胞增加幅度中藥血清組最明顯，中藥血清組與空白對照組及空白血清組增加幅度比較均有顯著性差異(P＜0.01)。③DNA凝膠電泳法檢測結(jié)果:可見典型的細胞凋亡“梯狀”電泳帶。

3 討論

桂枝芍藥知母湯是《金匱要略》中的名方，具有祛風(fēng)散寒除濕、溫陽行痹和柔筋定痛等功效。本方溫而不傷陰，如晨僵、關(guān)節(jié)腫痛、血沉、C反應(yīng)蛋白等臨床癥狀和實驗室指標(biāo)均有明顯改善，有較好的消炎、鎮(zhèn)痛及消腫等作用[3-5]。

表1 各組大鼠滑膜細胞凋亡和P53表達的結(jié)果±s)

表1 各組大鼠滑膜細胞凋亡和P53表達的結(jié)果±s)

注：與正常組比較，*P＜0.05；與對照組比較，ΔP＜0.05。

組別 例數(shù) 凋亡細胞數(shù)/每視野 P53表達積分正常組 10 0.73±0.36 0.21±0.11對照組 10 3.25±0.97* 1.94±0.78*實驗組 10 9.41±5.33*Δ 0.34±0.27Δ

表2 各組大鼠滑膜細胞凋亡和Bcl-2蛋白表達的結(jié)果

表3 各組大鼠滑膜細胞凋亡和Fas表達的結(jié)果

Bcl-2是一個定位于核膜、部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體外膜的癌蛋白，可保護細胞免于凋亡，并可特異的抑制P53介導(dǎo)的凋亡及生長抑制[6]；Fas是細胞表面的蛋白受體分子，分布于多種組織細胞，參與清除機體中被外來微生物感染的細胞和機體不再需要的細胞[7]；而P53是一種腫瘤抑制蛋白，可抑制細胞增殖和激活細胞凋亡，但突變型P53蛋白失去原有的抑癌功能，同時與野生型P53蛋白結(jié)合后可導(dǎo)致機體自身免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗P53抗體[8]。

從本實驗可得出，桂枝芍藥知母湯濃縮液可明顯減輕類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜增殖的病理改變，其作用是可能通過減弱大鼠滑膜細胞內(nèi)Bcl-2表達，而提高Fas的表達，誘導(dǎo)滑膜細胞調(diào)亡，從而恢復(fù)細胞增生與凋亡的平衡。對照組P53蛋白的表達較正常組和治療組增高，說明桂枝芍藥知母湯治療RA可能是通過抑制突變型p53的表達抑制滑膜細胞過度增生并誘導(dǎo)其調(diào)亡，從而發(fā)揮治療作用。

表4 各組大鼠滑膜細胞凋亡和P53表達的結(jié)果(±s)

表4 各組大鼠滑膜細胞凋亡和P53表達的結(jié)果(±s)

注：與正常組比較，*P＜0.05；與對照組比較，ΔP＜0.05。

組別 凋亡細胞數(shù)/每視野 P53表達空白對照組 1.01±0.68 0.59±0.32空白血清組 4.51±1.12* 1.60±0.75中藥血清組 10.56±4.96*Δ 0.60±0.89

表5 各組大鼠滑膜細胞凋亡和Bcl-2蛋白表達的結(jié)果

表6 各組大鼠滑膜細胞凋亡和Fas表達的結(jié)果

總之，通過桂枝芍藥知母湯對大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型滑膜細胞凋亡基因調(diào)控體內(nèi)、體外的實驗研究，初步證明了桂枝芍藥知母湯對RA滑膜細胞較強的誘導(dǎo)凋亡作用，為臨床上治療RA提供了實驗和理論依據(jù)，同時桂枝芍藥知母湯在誘導(dǎo)RA滑膜細胞凋亡的作用機制非常復(fù)雜，涉及體液、內(nèi)分泌、免疫網(wǎng)絡(luò)中的多種調(diào)節(jié)因子、多種轉(zhuǎn)錄、代謝調(diào)控因素，故還需從其他相關(guān)基因或蛋白表達方面做進一步研究。

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