董麗紅,吳 霞

(1.淮安生物工程高等職業(yè)學(xué)校,江蘇淮安 223200;2.山東大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,山東濟(jì)南 250100)

光譜法研究6-糠氨基嘌呤與牛血清白蛋白的相互作用

董麗紅1,吳 霞2

(1.淮安生物工程高等職業(yè)學(xué)校,江蘇淮安 223200;2.山東大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,山東濟(jì)南 250100)

利用熒光光譜法、紫外光譜法、熒光壽命和圓二色光譜法等方法研究了6-糠氨基嘌呤(KT)與牛血清白蛋白(BSA)之間相互作用機(jī)理.結(jié)果表明,KT可以顯著猝滅BSA的內(nèi)源熒光,其猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅,猝滅常數(shù) Ksv在288 K和303 K時分別為1.45×104和1.42×104L/mol,Stern-Volmer曲線是兩段相交于 cKT=8.0×10-5mol/L的回歸曲線,說明 KT與BSA之間存在兩類結(jié)合位點(diǎn).數(shù)據(jù)處理及熱力學(xué)參數(shù)計算表明:低濃度 KT-BSA(cKT<8.0×10-5mol/L)的結(jié)合主要是疏水作用,結(jié)合位點(diǎn)數(shù)約為1;較高濃度 KT(cKT>8.0×10-5mol/L)主要以氫鍵、范德華力與BSA結(jié)合,結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為3.7.紫外光譜和圓二色光譜實驗結(jié)果表明,KT的存在使BSA二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變.

6-糠氨基嘌呤;牛血清白蛋白;熒光光譜法

0 引言

細(xì)胞激動素(Kinetin,KT),學(xué)名為6-糠氨基嘌呤(6-Furfurylaminopurine),是一種高效的細(xì)胞生長刺激素,能促進(jìn)細(xì)胞的分裂、分化,延緩蛋白質(zhì)和葉綠素的降解.將其用于水稻、小麥、茶葉、黃瓜等作物能增加產(chǎn)量[1].蛋白質(zhì)是人體中重要的一類生物大分子,它與生命的起源、生物的進(jìn)化、細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、酶、病毒、營養(yǎng)均有密切關(guān)系.隨著化學(xué)的不斷發(fā)展,蛋白質(zhì)化學(xué)尤其是有關(guān)生物大分子與小分子探針的反應(yīng)已經(jīng)引起諸多科學(xué)工作者的關(guān)注,小分子在生物大分子上的聚集形式及機(jī)理的探討也已經(jīng)成為生命科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)和化學(xué)研究的重要內(nèi)容之一.

本文利用熒光光譜、紫外吸收光譜法研究了模擬生理條件(pH 7.40,NaCl:0.9%),KT與牛血清白蛋白(BSA)相互作用的機(jī)理,測定并計算出分子間相互作用的結(jié)合常數(shù),確定了 KT在血清白蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)與結(jié)合力類型.

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

LS-55型熒光磷光發(fā)光光度計(美國PE公司);U-4100紫外-可見分光光度計(日本日立);JASCO J-810圓二色光譜儀(日本分光);D320-S型酸度計(中國上海);Edinburgh FLS920型熒光分光光度計(英國愛丁堡公司).

牛血清白蛋白儲備液(BSA,上海潤捷化學(xué)試劑有限公司):1.0×10-4g/mL;6-糠氨基嘌呤溶液(KT,惠興生化):1.0×10-3mol/L);NaCl溶液(99.8%,南匯彭鎮(zhèn)公社營房化工廠):9%;Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.4,上海浩然生物技術(shù)有限公司):0.05mol/L.試劑均為分析純,實驗用水為三次蒸餾水.

1.2 實驗方法

在10mL比色管中依次加入0.5mL 9%NaCl溶液,0.5mL 0.05mol/LTris-HCl緩沖溶液,0.5mL 1.0×10-4g/mLBSA及一定體積的 KT溶液,用蒸餾水稀釋至5mL,振蕩搖勻,用1 cm石英比色池進(jìn)行測定.

熒光光譜:以280 nm為激發(fā)波長,在熒光分光光度計上掃描300～420 nm波長范圍內(nèi)的發(fā)射光譜,記錄347 nm處BSA的熒光強(qiáng)度.激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10 nm,波長掃描速度為500 nm/min.

同步熒光光譜:分別固定發(fā)射和激發(fā)波長的波長差Δλ=20 nm和Δλ=60 nm,在240～340 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行同步掃描,得到同步熒光光譜.激發(fā)狹縫為10 nm,發(fā)射狹縫為15 nm,波長掃描速度為500 nm/min.

2 結(jié)果與討論

2.1 KT對BSA的熒光猝滅作用和猝滅類型

2.1.1 KT對BSA的熒光猝滅作用

固定BSA濃度,以280 nm為激發(fā)波長,掃描不同濃度KT存在下體系在300～420 nm波長范圍內(nèi)的熒光光譜(NaCl:0.9%;Tris-HCl buffer:0.005 mol/L,pH 7.4,cBSA=1.0×10-5g/mL;cKT=0,1.0,2.5,4.0,5.5,7.0,8.5(×10-5)mol/L),如圖1所示.由圖可見,BSA在347 nm處有一強(qiáng)特征熒光峰,隨著 KT濃度的增加,BSA的熒光強(qiáng)度有規(guī)律的降低,峰形基本不變,說明KT與BSA之間存在相互作用.

圖1 KT對BSA的熒光猝滅光譜

若將猝滅劑對熒光體熒光的猝滅歸因于分子碰撞引起的動態(tài)猝滅,應(yīng)符合Stern-Volmer方程:

以 F0/F對[Q]繪制體系的Stern-Volmer圖,根據(jù)式(1)進(jìn)行線性回歸,通過直線斜率可得猝滅常數(shù)Ksv.當(dāng)熒光猝滅體系滿足條件:無論是動態(tài)還是靜態(tài)猝滅,必須是一個單一的過程;對于靜態(tài)猝滅,猝滅劑與熒光分子應(yīng)形成1∶1的復(fù)合物[2,3].此時,由 F0/F對[Q]作圖才會存在單一線性關(guān)系.

實驗繪制了不同溫度下KT對BSA熒光猝滅體系的Stern-Volmer圖(cBSA=1.0×10-5g/mL;cKT=0,1.0,2.5,4.0,5.5,7.0,8.0,9.0,10,11,12和13(×10-5)mol/L),如圖2.在所研究的濃度范圍內(nèi)進(jìn)行線性回歸處理.從圖中可看出,KT濃度在1.0×10-5mol/L～1.30×10-4mol/L范圍內(nèi),F0/F與 KT濃度并不是一條線性關(guān)系,而是兩段相交于 cKT=8.0×10-5mol/L的回歸曲線,即隨著 KT的濃度增加,曲線存在兩部分線性.這表明高濃度KT猝滅BSA內(nèi)在熒光的過程不同于低濃度.

表1 不同溫度下KT對BSA的猝滅常數(shù)和雙分子猝滅速率常數(shù)

我們認(rèn)為低濃度KT與BSA可能存在一個結(jié)合位點(diǎn)而高濃度KT與BSA可能存在多個結(jié)合位點(diǎn).KT濃度較低時,即 cKT<8.0×10-5mol/L,用Stern-Volmer方程計算不同溫度的猝滅常數(shù).另外由式(1)知道 Ksv=kqτ0,由于生物大分子的熒光壽命約為10-8s,故可進(jìn)而求得雙分子猝滅速率常數(shù) Kq(表1).從表1可以看出,隨著溫度的升高,猝滅常數(shù)減小;各類猝滅劑對生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)約為1010L/(mol·s)數(shù)量級,由表1可知,KT對BSA猝滅過程的速率常數(shù) Kq遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于此值,因此,初步判斷 KT濃度較低時,即 cKT<8.0×10-5mol/L時,該熒光猝滅為靜態(tài)猝滅.KT濃度較高,即 cKT>8.0×10-5mol/L時,若存在多結(jié)合位點(diǎn),則用Stern-Volmer方程計算的猝滅滅常數(shù)是不準(zhǔn)確的[4].

圖3 不同濃度KT對BSA熒光猝滅的對數(shù)曲線

圖2 KT與BSA作用的Stern-Volmer圖

2.1.2 體系的熒光壽命

熒光壽命的測定是區(qū)分靜態(tài)猝滅與動態(tài)猝滅最準(zhǔn)確的方法.實驗中利用單光子記數(shù)法測定了不同濃度 KT加入時BSA的熒光壽命.BSA本身的熒光壽命為6.98 ns,當(dāng) KT濃度為2.0×10-5mol/L、1.0×10-4mol/L時,BSA的熒光壽命分別為6.68 ns和6.82 ns.結(jié)果表明,KT的加入對BSA的熒光壽命影響不大,說明無論是高濃度還是低濃度的KT對BSA的熒光猝滅都以靜態(tài)猝滅為主.因此,KT在高、低濃度時Stern-Volmer出現(xiàn)兩條線性曲線可能歸因于 KT在低濃度下與BSA主要為強(qiáng)親和作用,而 KT濃度增大后,則存在多種親和作用[5-7].

2.2 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)

KT與BSA作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)可用以下公式求算[8]:

由圖2實驗數(shù)據(jù),以lg((F0-F)/F)對lg cKT繪圖,可得到線性回歸曲線(圖3).由直線的斜率和截距可得不同條件下KT與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù) K和結(jié)合位點(diǎn),見表2.

表2 不同溫度和不同濃度條件下KT與BSA作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)

文獻(xiàn)[9-11]認(rèn)為有些小分子配體與蛋白質(zhì)的作用,結(jié)合部位的變化與配體的濃度有關(guān),在配體濃度低時,與強(qiáng)結(jié)合力的部位發(fā)生作用,當(dāng)配體濃度增加時,配體則進(jìn)入低結(jié)合力的部位.由表2我們推測在低濃度時,KT以單一的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)入到BSA結(jié)合力較強(qiáng)的部位;高濃度時,KT又可結(jié)合到其它低結(jié)合力和低選擇性的位點(diǎn),導(dǎo)致結(jié)合位點(diǎn)數(shù)增加.

2.3 KT與BSA作用力的確定

由實驗數(shù)據(jù),我們計算了不同濃度KT與BSA作用的熱力學(xué)常數(shù),并根據(jù)結(jié)合力與熱力學(xué)參數(shù)的關(guān)系得出KT與BSA作用結(jié)合力類型(表3).

由表3并結(jié)合以上實驗我們認(rèn)為,低濃度KT(cKT<8.0×10-5mol/L)主要是靠疏水作用以單一的結(jié)合位點(diǎn)與BSA結(jié)合力較強(qiáng)的部位結(jié)合;由于KT分子結(jié)構(gòu)中呋喃環(huán)上氧原子的存在,較高濃度KT(cKT>8.0×10-5mol/L)還可主要以氫鍵、范德華力為主結(jié)合到其它低親和力的位點(diǎn),使得結(jié)合位點(diǎn)數(shù)增大.

表3 不同濃度KT與BSA作用的熱力學(xué)常數(shù)及結(jié)合力類型

2.4 結(jié)合位置

采用固定波長差進(jìn)行同步掃描時能將蛋白質(zhì)色氨酸和酪氨酸殘基的熒光區(qū)分開,可得到熒光基團(tuán)附近微環(huán)境的變化信息,并可以判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化.

有關(guān)研究表明BSA的空間結(jié)構(gòu)由三個結(jié)構(gòu)域組成,每一個結(jié)構(gòu)域由兩個亞結(jié)構(gòu)域以槽口相對的方式形成圓桶狀結(jié)構(gòu),幾乎所有疏水性氨基酸都包埋在圓桶內(nèi)部,構(gòu)成三個疏水腔,而在BSA分子表面存在著較大的疏水裂隙與這些疏水腔連通.BSA的序列分析表明BSA分子中有134和212兩個色氨酸殘基分別位于IB域和IIA域兩個不同的空間結(jié)構(gòu)域中,由于BSA分子表面較大的疏水裂隙的存在,134位色氨酸殘基位于BSA分子結(jié)構(gòu)的外層[12].

圖4 KT對BSA同步熒光光譜的影響

由圖4可以看出,在低濃度KT存在時,無論Δλ=20 nm還是Δλ=60 nm,隨著KT濃度的增加,色氨酸和酪氨酸殘基的最大波長均有紅移,而且強(qiáng)度降低,其中色氨酸殘基的熒光強(qiáng)度降低更大,說明6-BA主要是與色氨酸殘基結(jié)合.由于低濃度 KT(cKT<8.0×10-5mol/L)主要是通過疏水作用與BSA以單一的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,推測此條件下KT是與BSA的212位色氨酸殘基結(jié)合,使BSA內(nèi)部的疏水結(jié)構(gòu)有所瓦解,肽鏈的伸展程度增加,殘基所處微環(huán)境極性增強(qiáng),疏水性降低,另外由于色氨酸殘基和酪氨酸殘基之間的能量轉(zhuǎn)移因而使酪氨酸殘基的熒光強(qiáng)度也有所降低.當(dāng)KT濃度較高時對色氨酸殘基最大波長無明顯影響,而酪氨酸殘基的波長仍有明顯紅移,而且二者熒光強(qiáng)度進(jìn)一步降低.推測當(dāng)BSA的212位色氨酸殘基與KT的結(jié)合達(dá)到飽和以后,由于KT分子結(jié)構(gòu)中呋喃環(huán)上氧原子的存在,較高濃度 KT(cKT>8.0×10-5mol/L)還可主要以氫鍵、范德華力為主結(jié)合到BSA的134位色氨酸殘基及酪氨酸殘基等其它低親和力的位點(diǎn),使得結(jié)合位點(diǎn)數(shù)增大.由于134位色氨酸殘基位于BSA分子結(jié)構(gòu)的外層,因此 KT與其結(jié)合對它所處微環(huán)境極性影響較小,故而對色氨酸殘基最大波長不再有明顯影響,但對酪氨酸殘基的波長仍有一定影響.

2.5 BSA的構(gòu)象變化

2.5.1 KT對BSA的紫外吸收的影響

蛋白質(zhì)在遠(yuǎn)紫外區(qū)域的吸收,主要是肽鍵-CONH-所導(dǎo)致的.BSA在200 nm附近的吸收峰能夠反映蛋白質(zhì)骨架結(jié)構(gòu)的改變,BSA與 KT反應(yīng)前后的紫外可見光譜圖(cBSA=1.0×10-5g/mL;cKT=0,1.0,2.0,8.0,9.0(×10-5)mol/L).圖5顯示,BSA溶液中加入KT后,BSA 192 nm處的吸收峰隨著KT濃度的增大紅移至196 nm處,吸收強(qiáng)度減小.吸收峰紅移、吸收強(qiáng)度減小說明KT的加入使BSA骨架結(jié)構(gòu)周圍的微環(huán)境極性發(fā)生了改變,并導(dǎo)致BSA的構(gòu)象改變,α-螺旋含量升高,發(fā)生了去折疊過程.

圖6 KT-BSA的圓二色光譜圖

圖5 KT-BSA的吸收光譜圖

2.5.2 圓二色光譜

通過遠(yuǎn)紫外圓二色光譜研究了KT誘導(dǎo)的BSA構(gòu)象的變化并得到相應(yīng)譜圖(cBSA=2.0×10-5g/mL;cKT=6.0×10-5mol/L.圖中:1表示BSA,2表示KT-BSA).由圖6可看出,KT的加入使BSA在220 nm和209 nm處的橢圓率發(fā)生變化,數(shù)據(jù)處理結(jié)果表明BSA分子中α-螺旋含量由32.6%增加到33.4%,同時,β-折疊的含量由36.9%降為31.9%.

3 結(jié)論

實驗在模擬生理條件下,研究了KT與BSA作用的性質(zhì)(包括熒光猝滅機(jī)理、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、作用力類型和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化).實驗結(jié)果表明KT與BSA的結(jié)合存在兩類結(jié)合位點(diǎn),這兩類結(jié)合位點(diǎn)都是以靜態(tài)的方式猝滅BSA的內(nèi)在熒光.低濃度KT-蛋白(cKT<8.0×10-5mol/L)的結(jié)合主要是靠疏水作用,以單一的結(jié)合位點(diǎn)強(qiáng)烈地與BSA的212位色氨酸殘基結(jié)合;較高濃度 KT(cKT>8.0×10-5mol/L)還可主要以氫鍵、范德華力為主結(jié)合到其它低親和力的位點(diǎn),使得結(jié)合位點(diǎn)數(shù)增大.紫外光譜、同步熒光光譜、圓二色光譜等研究表明,KT的加入使BSA骨架結(jié)構(gòu)周圍環(huán)境的極性發(fā)生了變化,導(dǎo)致BSA構(gòu)象發(fā)生了改變.

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Abstract:The interactionmechanism of Kinetin(KT)with BSA was studied by themethodsof fluorescence,fluorescence lifetime,UV absorption and CD spectrometries.KT could strongly quench the intrinsic fluorescence of BSA by static quenching.The quenching constantsof KTwith BSA at two temperatures(288K and 303K)wereobtained as 1.45×104and 1.42×104L/mol.The Stern Volmer curve had an intersection at cKT=8.0×10-5mol/L,which indicated that KT bound to different binding sites on BSA.The analytical results of fluorescence data showed when cKT<8.0×10-5mol/L,the numberof binding siteswas near 1,andwhen cKT>8.0×10-5mol/L,the numberof binding siteswas approximately 3.7.The thermodynamic parameterswere calculated by Van’t Hoff equation.The enthalpy change enthalpy change(Δ H)and entropy change(ΔS)were calculated at two concentration of KT.The results suggested that the hydrophobic interaction might play a main role in the interaction of KT(cKT<8.0×10-5mol/L)with the BSA,while cKT>8.0×10-5mol/L the hydrogen bonding and Vander Waals forces becamemajor.The investigations of the UV/Vis and CD spectra of the system showed that the secondary structure of BSA was changed in presence of KT.

Key words:kinetin;sodium dodecyl sulfonate;fluorescence

[責(zé)任編輯:蔣海龍]

Studies on the Interaction of Kinetin with Sodium Dodecyl Sulfonate by SpectroPhotometry

DONGLi-Hong1,WU Xia2

(1.Huaian Higher Vocational School of Biological Engineerin,Huain Jiangsu 223200,China)
(2.School of Chemistry and Chemical Engineering,Shandong University,Jinan Shandong 250100,China)

O657.3

A

1671-6876(2010)06-0501-06

2010-06-29

董麗紅(1973-),女,講師,碩士,主要從事分析化學(xué)及教學(xué)研究.