劉曉艷, 李英麗, 王珍珍, 王 君, 張新穎, 田 翔, 趙 月

(1.上海大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,上海 200444;2.黑龍江省第四地質(zhì)勘察院,哈爾濱 150001)

強(qiáng)化嗜油微生物對(duì)鹽堿土中石油類(lèi)污染物的降解

劉曉艷1, 李英麗2, 王珍珍1, 王 君1, 張新穎1, 田 翔1, 趙 月1

(1.上海大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,上海 200444;2.黑龍江省第四地質(zhì)勘察院,哈爾濱 150001)

利用從油田試驗(yàn)場(chǎng)油污土壤樣品中分離出來(lái)的嗜油微生物,選擇典型的石油與鹽堿土制成的含油污泥作為研究對(duì)象.通過(guò)實(shí)驗(yàn)?zāi)M,研究不同條件下微生物對(duì)油類(lèi)污染物的降解作用特征.實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明:在含水率 50%及施加了氮磷比為 10∶1營(yíng)養(yǎng)物的樣品中,微生物對(duì)油污的降解效果最好;通過(guò)施加適量的 H2O2,可增強(qiáng)微生物的活性,進(jìn)而提高微生物的降解油污能力;提供適宜條件,可以有效地加強(qiáng)嗜油微生物的降解能力及其對(duì)鏈烷烴的選擇性降解.

嗜油微生物;石油污染物;鹽堿土;降解

Abstract:The typical petroleum and oil-contaminated saline-alkali soil were chosen as samples.Aboriginal microorganisms were isolated from petroleum-contaminated soils at the oilfield test site.M icrobial degradation characteristics of petroleum pollutants were studied in simulations under different conditions.Experimental results show that degradation rates of micro-organisms were high in samples under the conditions of 50%water rate and 10∶1 N/P ratio. In addition,the microbial activity and degradation ability can be enhanced by using moderate H2O2to improve the oxygen content in the samp les.If suitable conditions can be provided,degradation and selective consumption of microbes for paraffins can be effectively increased,and used for molecular markersof petroleum pollution.

Key words:aboriginal-microbe;petroleum pollutant;saline-alkali soil;degradation

全世界每年約有近 800萬(wàn) t石油污染物進(jìn)入環(huán)境,而我國(guó)每年有近 60萬(wàn) t進(jìn)入環(huán)境[1],其中大部分污染物進(jìn)入到土壤中.石油類(lèi)污染物中的“三致”物質(zhì)會(huì)被水體和土壤中的動(dòng)植物所富集,并通過(guò)食物鏈傳遞給人體.當(dāng)進(jìn)入土壤的油濃度過(guò)高時(shí),土壤孔隙會(huì)被堵塞而影響通氣性,并且大量土壤結(jié)構(gòu)的活性表面會(huì)被油類(lèi)包裹,會(huì)使嗜油微生物的活性受到抑制,導(dǎo)致其降解能力下降[2].目前,我國(guó)每年有近 10萬(wàn) t石油污染土壤有待解決[3].20世紀(jì) 80年代發(fā)展起來(lái)的微生物修復(fù)方法由于其操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低、污染物氧化完全、無(wú)二次污染、可原位處理等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)成為石油污染治理方法的主流[2-5].

在微生物降解石油烴污染物的過(guò)程中,微生物的數(shù)量對(duì)降解速度有很大的影響,微生物增長(zhǎng)率最快的時(shí)期最有利于石油烴污染物的快速去除[6].微生物通過(guò)不同方式最終將污染物轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定無(wú)毒的終產(chǎn)物,如水、CO2、簡(jiǎn)單醇或酸及微生物自身的生物量[7].影響微生物降解石油的因素十分復(fù)雜,包括溫度、水分、氧氣、pH值、表面活性劑、營(yíng)養(yǎng)條件等外部條件因素,石油的物理狀態(tài)、產(chǎn)地、來(lái)源和其中所含組分的差異及其濃度都可能影響其降解.我國(guó)的石油烴污染土壤中均含有一定數(shù)量與活性的除油微生物,其石油烴含量水平與組成特性均有一定的生物降解性,改善油污土的微生態(tài)環(huán)境非生物因子可取得較理想的生物治理效果[8].土著微生物相對(duì)于外源混合菌在石油污染土壤的生物修復(fù)中可以發(fā)揮更重要的作用[9].微生物的生長(zhǎng)繁殖需要碳、氮、氧、磷和其他各種礦物質(zhì)元素.營(yíng)養(yǎng)元素是參與微生物細(xì)胞組成、構(gòu)成酶的活性成分、物質(zhì)運(yùn)輸系統(tǒng)以及提供生理活動(dòng)所需的能量.在油污土壤中,有機(jī)碳含量很高,碳已不是限制條件.但石油烴進(jìn)入土壤后,會(huì)破壞土壤結(jié)構(gòu),分散土粒,使土壤透水性降低,其與無(wú)機(jī)氮、磷結(jié)合并限制硝化作用和脫磷酸作用,從而使土壤有效氮、磷的含量減少[2].研究表明,氮、磷營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏或過(guò)量均可限制石油烴的降解,氮、磷的最佳比例與細(xì)胞成分中的比例 (氮磷比為5.67∶1)越接近越有利于提高微生物降解能力[2,6,10-11].Audrew等研究原油在土壤中泄漏后的生物降解能力時(shí)發(fā)現(xiàn),當(dāng)添加肥料的碳、氮、磷的比例為100∶5∶1.7并為緩慢釋放形式時(shí),效果最佳,其中 N源主要利用NH4+,P源主要利用 PO34-[12-13].不同原油由于其飽和烴、芳香烴、膠質(zhì)和瀝青質(zhì)的含量以及飽和烴中正構(gòu)烷烴的含量不同,而具有不同的抗降解性[6].為了達(dá)到較好的修復(fù)效果,在向石油污染土壤添加 N,P的營(yíng)養(yǎng)物時(shí),必須首先確定營(yíng)養(yǎng)鹽的形式、濃度以及適當(dāng)?shù)谋壤?

本研究利用某油田受原油污染的典型的鹽堿土,從石油污染土壤中篩選出嗜油微生物,然后將其投加到油污土壤中,研究土著微生物專(zhuān)性降解該類(lèi)土壤的最優(yōu)營(yíng)養(yǎng)條件,并對(duì)降解效果進(jìn)行分析.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 樣品

石油污染物樣品為某油田 P油層石油.土壤樣品為東北地區(qū)典型的鹽堿土,該土壤中含有氮 1.66 g/kg,磷 2.20 mg/kg.嗜油微生物是取自油田試驗(yàn)場(chǎng)石油污染土壤,并通過(guò)分離培養(yǎng)而篩選出的菌群.

1.2 儀器和設(shè)備

恒溫水浴振蕩儀、恒溫培養(yǎng)箱、普通天平、電子天平、電熱濤、顯微鏡、多用振蕩器、高壓鍋、熱解烴分析儀 (GHM)等.

1.3 藥品

H2O2(30%)、原油、葡萄糖、瓊脂、蛋白胨、石油醚、硫酸、氯化銨和磷酸二氫鉀等,以上試劑均為分析純.

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

取 4份鹽堿土壤,每份 1 000 g,將土壤自然晾干過(guò) 40目篩.另取石油配制成含油量為 100 g/kg的油污土樣品,置于 250 mL三角瓶中,保持在恒溫空氣浴振蕩器中,振蕩處理 24 d.然后,分別選擇不同含水率、含氧量及氮磷營(yíng)養(yǎng)物等條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,氮磷營(yíng)養(yǎng)物用氯化銨與磷酸二氫鉀配制,按設(shè)定的氮磷比投加.選擇氮磷比為 6∶1,10∶1,30∶1,50∶1和60∶1五種不同的營(yíng)養(yǎng)系列進(jìn)行研究,以 6∶1為例,實(shí)驗(yàn)土樣中加入的氮、磷濃度分別為2.250,0.375 g/kg.在保持磷濃度不變的情況下,配制其他氮磷比營(yíng)養(yǎng)系列.例如,配制 100 g/kg油污土實(shí)驗(yàn)樣品后,向錐形瓶中分別加入氮磷營(yíng)養(yǎng)物,將制備好的樣品放在振蕩儀上連續(xù)振蕩 24 d,期間要注意保持樣品的含水率.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,通過(guò)測(cè)定樣品中有機(jī)質(zhì)的降解率,可以反映出微生物對(duì)石油污染物的降解特征.這是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)用鹽堿土樣品中的有機(jī)質(zhì)含量很低,土壤中的石油類(lèi)污染物是土壤有機(jī)質(zhì)的主要組成部分.樣品中石油烴測(cè)定方法是將振蕩 24 d后的樣品取出、晾干、磨細(xì)后,通過(guò)使用 GHM對(duì)樣品中的殘留烴進(jìn)行定性和定量分析.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 含水率對(duì)油污降解率的影響

在不同含水率條件下,微生物對(duì)含石油污染物濃度為 100 g/kg的油污土試驗(yàn)樣品的降解特征如圖1所示.

圖1 微生物對(duì)不同含水率的油污樣品中有機(jī)質(zhì)的降解率Fig.1 M icrob ial degradation rate of oil-con tam inated samples under d ifferent moistures

圖2 不同營(yíng)養(yǎng)條件下微生物對(duì)油污降解率的影響Fig.2 M icrobial degradation rate of oil pollutants under d ifferent nutr ients

圖1可見(jiàn),油污樣品含水率對(duì)嗜油微生物降解石油能力的影響比較明顯.在含水率低于 50%的條件下,微生物降解石油的能力隨含水量的增加而加強(qiáng);但是,當(dāng)含水率高于 50%后,隨含水量的增加,微生物的降解能力則開(kāi)始逐漸減弱.實(shí)際上,土壤中的微生物需要水來(lái)維持基本的新陳代謝.土壤含水量過(guò)低,微生物得不到充足的水分供應(yīng),細(xì)胞活性受到抑制,會(huì)導(dǎo)致其代謝速率降低;而土壤含水量過(guò)多,會(huì)妨礙空氣的通透和氧氣的供應(yīng).根據(jù)微生物活性所需的條件,在土壤水分為最大持水量的 30%～80%范圍內(nèi),石油烴的降解較為有利;在水分低于30%或高于 90%時(shí),對(duì)石油烴降解菌的活動(dòng)就會(huì)產(chǎn)生不利影響[14].這一現(xiàn)象說(shuō)明:微生物的生長(zhǎng)繁殖需要一定的含水條件,加之水是微生物一些酶類(lèi)的必需品;但是,過(guò)多的水會(huì)阻止微生物與氧氣有效的接觸,造成微生物缺氧,對(duì)微生物降解石油的能力起到抑制作用.

2.2 氮磷營(yíng)養(yǎng)物對(duì)油污降解率的影響

大量實(shí)踐證明,在眾多漏油事故中,氮與磷的含量經(jīng)常嚴(yán)重限制微生物對(duì)石油的降解.營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏就會(huì)抑制微生物對(duì)石油烴的降解作用,并且在自然條件下,氮源和磷源經(jīng)常成為微生物降解烴類(lèi)的限制因子[10].在一定油污濃度范圍內(nèi),適量地增加N源、P源可以加速油污的降解作用.在含水率 50%條件下,不同的氮磷比營(yíng)養(yǎng)條件下,微生物對(duì)濃度為100 g/kg的油污土試驗(yàn)樣品的降解特征如圖2所示.

微生物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要為碳、氮、磷.由于石油污染導(dǎo)致了 C源的大量增加,足以保證其 C源供應(yīng),而大多數(shù)土壤的 N,P含量都很低.為了達(dá)到更好的微生物修復(fù)效果,必須添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),一般需要添加一定量的營(yíng)養(yǎng)鹽,以確保修復(fù)過(guò)程中微生物生長(zhǎng)的需要.本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了五種不同比例進(jìn)行測(cè)試,還有空白對(duì)比 (不添加任何營(yíng)養(yǎng)物質(zhì))實(shí)驗(yàn).可以看出,在不同的氮磷比條件下,微生物對(duì)污染濃度為100 g/kg的油污鹽堿土的降解效果在 10∶1條件下是最好的,而且相對(duì)于空白樣品,其降解率提高幅度很大 (53.9%).總的看來(lái),實(shí)驗(yàn)的各種比例都對(duì)微生物的降解有明顯的促進(jìn)作用,但考慮到經(jīng)濟(jì)性及降解率因素,選擇添加氮磷比為 10∶1最佳.雖然營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是影響微生物活性的外因,但它對(duì)微生物降解能力的影響是非常明顯的.目前國(guó)內(nèi)外的一些研究也證實(shí),在土壤中添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以在短時(shí)間內(nèi)使油類(lèi)污染物的含量大大降低,最佳氮磷比值大約為 10∶1[15].

2.3 加入 H2O2對(duì)油污降解的影響

微生物在降解石油烴的過(guò)程中不斷消耗樣品中的溶解氧,使溶解氧的濃度不斷下降.本研究在實(shí)驗(yàn)中將 H2O2加入到樣品中,通過(guò) H2O2不斷發(fā)生分解以補(bǔ)充被微生物消耗掉的溶解氧.為保持樣品中的溶解氧量,每天加入一定量的 H2O2以滿(mǎn)足微生物生長(zhǎng)的需要.同時(shí),由于 H2O2具有強(qiáng)的氧化作用,若 H2O2加入量過(guò)高,就會(huì)對(duì)微生物產(chǎn)生抑制作用,因此,本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定加入 H2O2量的上限值為 0.5 mL/d.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,在保證其他因素最佳的條件下,針對(duì) 100 g/kg油污土 1～4號(hào)試驗(yàn)樣品,每天分別施加 0.1,0.2,0.5及 0.6 mL H2O2的條件下,微生物對(duì)油污的降解特征如圖3所示.

可以看出,氧含量對(duì)微生物降解石油能力的影響也是比較大的.隨著 H2O2的加入,微生物的活性逐漸加強(qiáng),降解能力也逐漸提高.當(dāng)在 24 d內(nèi),累計(jì)加入H2O2達(dá)到12 mL時(shí),降解效率達(dá)到最大值.而且可以從含油土壤中微生物數(shù)量的測(cè)定中得知,試驗(yàn)樣品中的活菌數(shù)隨 H2O2的加入而逐漸提高,活菌數(shù)的增加必然會(huì)加快油類(lèi)污染物的降解速度.另外,在加入 H2O2的情況下,泥漿的 pH值可以保持穩(wěn)定,不發(fā)生明顯變化.在缺乏電子受體的情況下,微生物對(duì)脂肪酸的氧化難于進(jìn)行,不能將烴類(lèi)污染物完全氧化,從而使一些短鏈脂肪酸在試驗(yàn)樣品中積聚,致使 pH值下降.若提供了充足的電子受體,就會(huì)使微生物將烴類(lèi)化合物完全氧化成 CO2和H2O,從而使樣品的 pH值保持穩(wěn)定.這有利于微生物的生長(zhǎng)繁殖,增強(qiáng)其活性,從而導(dǎo)致微生物的降解效果更加明顯[15-16].

2.4 不同氮磷比條件下鏈烷烴類(lèi)的降解特征

在不同氮磷比條件下,微生物對(duì)污染濃度為100 g/kg的油污樣品降解后殘留的鏈烷烴類(lèi)相對(duì)含量如圖4和圖5所示.由圖4和圖5可知:在不同氮磷比條件下,當(dāng)?shù)妆葹?10∶1時(shí),各種碳數(shù)的正構(gòu)烷烴與異構(gòu)烷烴在降解后的剩余含量最少;而在其他氮磷比情況下,正構(gòu)烷烴及異構(gòu)烷烴的剩余量均較高.實(shí)驗(yàn)證明,為嗜油微生物提供適量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能夠有效地加強(qiáng)微生物的降解能力,促使嗜油微生物有效地降解石油中的鏈烷烴類(lèi)污染物.同時(shí)也反映出:嗜油微生物對(duì) C16～C21范圍內(nèi)的正構(gòu)烷烴的降解作用是比較均衡的;但嗜油微生物對(duì)于 C15～C20范圍內(nèi)的異構(gòu)烷烴的消耗具有選擇性;對(duì) C16類(lèi)異戊二烯烴及姥鮫烷 (Pr)、植烷 (Ph)的降解率明顯低于 C15,C18類(lèi)異戊二烯烴及姥鮫烯-2(Pr-2)及甲基菲(MP)類(lèi)異構(gòu)烷烴.這種選擇性降解的特征說(shuō)明Pr,Ph的難降解性,同時(shí)也可以利用 Pr,Ph的穩(wěn)定性特征,使用 Pr及 Ph作為石油類(lèi)污染物降解的分子標(biāo)志物.

圖3 不同 H2O2條件下微生物對(duì)油污降解率的影響Fig.3 M icrob ial degradation rate of oil pollutan ts under d ifferent H2O2cond ition

圖4 在不同營(yíng)養(yǎng)條件下油污土中正構(gòu)烷烴的降解特征Fig.4 Degradation character istics of normal alkanes in oily soils under d ifferent nutr ients

圖5 在不同營(yíng)養(yǎng)條件下油污土中異構(gòu)烷烴的降解特征Fig.5 Degradation character istics of iso-alkanes in oily soils under d ifferent nutr ients

3 結(jié) 論

(1)嗜油微生物在油污土壤含水率 50%的條件下降解石油污染物的能力強(qiáng);

(2)在施加營(yíng)養(yǎng)物的氮磷比為 10∶1的條件下,微生物對(duì)油污的降解效果最好;

(3)含氧量對(duì)微生物降解石油能力的影響較大,在施加適量 H2O2的條件下,微生物的活性逐漸加強(qiáng),降解油污能力逐漸提高;

(4)提供適量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可有效加強(qiáng)嗜油微生物的降解能力,并可促使其選擇性地降解污油中的鏈烷烴類(lèi)污染物.實(shí)驗(yàn)還證明,嗜油微生物對(duì) C16～C21范圍內(nèi)的正構(gòu)烷烴的降解作用比較均衡,而對(duì)C15～C20范圍內(nèi)的異構(gòu)烷烴的降解具有選擇性.

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(編輯:孟慶勛)

Degradation of Petroleum Pollutants in Saline-Alkali Soils Using Abor iginal M icrobe

L IU Xiao-yan1, L IYing-li2, WANG Zhen-zhen1, WANGJun1, ZHANGXin-ying1,TIAN Xiang1, ZHAO Yue1
(1.School of Environmental and Chemical Engineering,Shanghai University,Shanghai200444,China;2.Fourth Geological Exp loration Institute of Heilongjiang Province,Harbin 150001,China)

X 172

A

1007-2861(2010)05-0460-05

10.3969/j.issn.1007-2861.2010.05.003

2010-07-14

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41073072);上海市重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)資助項(xiàng)目(S30109);黑龍江省教育基金資助項(xiàng)目(10541005);上海大學(xué)創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(A10011108009)

劉曉艷 (1962～),女,教授,博士生導(dǎo)師,研究方向?yàn)槲廴经h(huán)境防治與生態(tài)修復(fù).E-mail:lxy999@shu.edu.cn