杜 軍，李憶軍

（湖南省津市市人民醫(yī)院藥劑科，湖南津市 415400）

拉莫三嗪（1amotrigine，LTG）為一種新型的廣譜抗癲癇藥，對(duì)部分性發(fā)作、GTCS、Lennox-Gastaut綜合征、失神發(fā)作和肌陣攣發(fā)作有效，臨床上用于難治性癲癇的輔助治療[1-3]。由于其半衰期較長(zhǎng)（24～30 h），可以每日1次給藥。苯巴比妥（phenobarbital，PBT）常作為小兒癲癇的首選藥物，廣譜，起效快，對(duì)GTCS療效好，也用于單純及復(fù)雜部分性發(fā)作，對(duì)發(fā)熱驚厥有預(yù)防作用[4-5]，半衰期長(zhǎng)達(dá)37～399 h。上述藥物的治療范圍窄，且抗癲癇效果、藥物不良反應(yīng)與藥動(dòng)學(xué)特征有關(guān)。為了評(píng)價(jià)療效或確定給藥方案，使給藥方案?jìng)€(gè)體化，以提高藥物治療水平，達(dá)到臨床安全、有效、合理的用藥。因此開(kāi)展治療藥物監(jiān)測(cè)有重要臨床意義。本研究在文獻(xiàn)[2-6]的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，采用以氯硝西泮（Clonazepam，CNZ）為內(nèi)標(biāo)，建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定兩者的濃度，為臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent高效液相色譜分析儀（美國(guó)Agilent公司）；低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Beckman公司）；KQ50B型超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；XW-80A漩渦混和器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；電子分析天平（AG285型，瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 試藥

LTG對(duì)照品（批號(hào)：051130，葛蘭素史克制藥有限公司，純度：99.5%）；苯巴比妥對(duì)照品（批號(hào)：171222－200504，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；內(nèi)標(biāo)氯硝西泮（批號(hào)：150230-200201，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；乙腈、甲醇、二氯甲烷均為進(jìn)口色譜純（美國(guó)Tedia公司）；磷酸鉀緩沖液（PBS，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，分析純）；異丙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純）；水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：AgilentZorbaxXDB-Cl8柱（150mm×4.6mm，5μm）色譜柱；流動(dòng)相：0.1%乙酸-乙腈；梯度程序?yàn)椋?.00→7.00 min，A∶B=90∶10；7.00→12.00 min，A∶B=70∶30；12.00→14.00 min，A∶B=90∶10。流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm；柱溫：40℃；內(nèi)標(biāo)：氯硝西泮；結(jié)果表明，LTG、PBT和CNZ的保留時(shí)間分別約為6.2、10.8和12.7 min，各成分峰形良好，分離完全。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)貯備液的制備

精密稱取 LTG、PBT 和 CNZ 10.0、10.0和 5.00 mg，分別置于25 ml量瓶中，加甲醇溶液溶解并定容配制成400.0，400.0和 200.0 μg/ml的貯備液。

2.3 樣本采集

清晨患者服藥前抽取靜脈血2 ml，室溫3500 r/min離心8 min，分離并留取血清，置-20℃冰箱保存，待測(cè)。

2.4 血樣預(yù)處理

冰箱中取出血清，室溫解凍，吸取血清200 μl，置5 ml的離心管中，加入CNZ貯備液 10 μl、乙酸乙酯1 ml，渦旋混合60 s，3500 r/min離心10 min，吸取乙酸乙酯，于40℃用氮?dú)獯蹈?，加入甲醇溶?00 μl溶解，精密吸取取20 μl進(jìn)樣。

2.5 線性關(guān)系考察

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)血樣 精密量取“2.2”項(xiàng)下貯備液適量，用甲醇溶液稀釋，加入適量空白人血清，制成含 LTGl.0～50.0 μg/ml、PBT 1.0～150.0 μg/ml的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)血樣。

2.5.2 線性試驗(yàn) 取 “2.5.1” 項(xiàng)下含 LTG分別為1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/ml，含 PBT 分別為 1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、150.0 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)血樣，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣測(cè)定，分別以樣品與內(nèi)標(biāo)的峰面積比Y對(duì)濃度C線性回歸，得 LTG 標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=0.1739C-0.0221（r=0.9991）；PBT標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.2105C+0.0337（r=0.9990）。表明血清中 LTG 在 1.00～50.00 μg/ml和 PBT 在 1.0～150.0 μg/ml的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

取人空白血清200 μl，分別加入LTG和PBT對(duì)照品工作液，配成濃度為 2.00、20.00和 40.00 μg/ml和濃度為 5.0、20.0和50.0μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)血清。按“2.4”項(xiàng)下方法操作，分別測(cè)得兩藥物的回收率及日內(nèi)、間精密度，結(jié)果見(jiàn)表1。LTG及PBT的平均回收率均＞97.0%，日內(nèi)精密度＜4.3%，日間精密度＜5.4%。

2.7 干擾實(shí)驗(yàn)

在此色譜條件下，苯妥英鈉和卡馬西平的保留時(shí)間分別為15.1 min和21.3 min，對(duì)兩種藥物峰及內(nèi)標(biāo)峰均無(wú)干擾。用本法監(jiān)測(cè)的56例樣品中，亦未見(jiàn)有其他峰干擾。

2.8 人體血樣測(cè)定

本法用于數(shù)例患者服藥達(dá)穩(wěn)態(tài)后（門(mén)診患者兩藥均服用1個(gè)月后），血清中藥物谷濃度（清晨抽取服藥前患者空腹血）的測(cè)定，患者血清色譜圖見(jiàn)圖2。

表1 拉莫三嗪、苯巴比妥回收率和日內(nèi)、日間精密度及回收率Tab.1 Recovery，precisions of intra-day and inter-day of lamotrigine and phenobarbital

3 討論

3.1 兩種藥物的結(jié)構(gòu)及藥理作用

LTG是一聯(lián)苯三嗪衍生物，為抗癲癇新藥，通過(guò)作用于鈉離子通道，抑制興奮型神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，從而達(dá)到藥理活性[7]，近年來(lái)已成為血藥濃度檢測(cè)的目標(biāo)藥物。PBT是苯巴比妥（Phenobarbital，PBT）為嘧啶類衍生物，為 GABAA受體激動(dòng)劑，作用于巴比妥酸位點(diǎn)而增加Cl-的傳導(dǎo)[8]。癲癇的治療一般主張單藥治療，但對(duì)于難治性癲癇往往采用聯(lián)合用藥作用于不同靶點(diǎn)而發(fā)揮療效[9]。常用的抗癲癇藥物由于其治療指數(shù)小，個(gè)體差異大往往需監(jiān)測(cè)合并使用的抗癲癇藥的血藥濃度。文獻(xiàn)[3]有對(duì)上述兩種藥物含量同時(shí)測(cè)定的報(bào)道，但對(duì)測(cè)量?jī)x器的配制要求較高，一般醫(yī)療單位不具備條件。本研究采用梯度洗脫法對(duì)化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)差別較大的成分進(jìn)行較理想分離并對(duì)其含量測(cè)定。

3.2 波長(zhǎng)的選擇

文獻(xiàn)[3]報(bào)道LTG在214 nm波長(zhǎng)處吸收最大，可提高LTG測(cè)定的靈敏度，但本法采用了240 nm的波長(zhǎng)，目的是為了兼顧PBT的含量測(cè)定，減少基線的飄移和雜質(zhì)峰的影響，完全滿足臨床上檢測(cè)的需要。

3.3 內(nèi)標(biāo)的選擇

文獻(xiàn)[6]報(bào)道LTG的含量測(cè)定中采用氟西泮作為內(nèi)標(biāo)物，PBT的含量測(cè)定[7-9]采用艾司唑侖為內(nèi)標(biāo)物。本實(shí)驗(yàn)曾嘗試用到該兩種化合物作內(nèi)標(biāo)，但在該色譜條件下與目標(biāo)峰分離效果不理想，后選用氯硝西泮，考慮到三者具有較理想的分離度，且峰位又不與其他抗癲癇藥物及內(nèi)源性物質(zhì)重疊，故本研究選擇氯硝西泮作為兩藥物含量同時(shí)測(cè)定的內(nèi)標(biāo)物。

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