王晉濤，郭建軍，尉志文，萬東方，王勇，王玉瑾，贠克明

苯巴比妥（phenobarbital）又稱魯米那（luminal），屬于長效巴比妥類鎮(zhèn)靜催眠藥，具有抗焦慮、鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥、抗癲癇及中樞性肌肉松弛作用［1］，已經(jīng)在臨床應(yīng)用多年。由于服用苯巴比妥中毒及大劑量苯巴比妥進行自殺報道的案例較多［2］，成為法醫(yī)工作者非常重視的臨床中毒藥物之一。目前，有關(guān)苯巴比妥的研究雖然有很多報道［3－6］，但主要集中于藥效學(xué)及藥動力學(xué)、作用機制及機體內(nèi)苯巴比妥含量的測定［5－9］，有關(guān)苯巴比妥死后分布研究較少。因此，本實驗建立苯巴比妥死后分布動物模型，研究苯巴比妥在大鼠體內(nèi)的死后分布規(guī)律，為苯巴比妥中毒死亡案件的檢材采取和結(jié)果分析提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 TRACE GC＆DSQ 氣相色譜／質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo Finnigan公司；TRACE 2000GC 氣相色譜儀，美國Thermo Finnigan公司。

1.2 氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀條件 DB－5MS毛細管柱（30m×0.25m×0.25μm），EI源70ev；質(zhì)量范圍50～650，柱溫130 ℃（1min）→10 ℃（1min）→240 ℃（2 min）；離子源溫度200 ℃，傳輸線溫度250 ℃，載氣：He，1.5mL／min。

1.3 氣相色譜條件 DB－5 毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），柱溫130 ℃（1min）→10 ℃（1min）→240 ℃（2 min）；檢測器：300 ℃，空氣60kPa，氫氣2.3kPa，載氣：N2，1.5mL／min，NPD 檢測器。

1.4 試劑 苯巴比妥對照品購于公安部物證鑒定中心，苯巴比妥片（上海金山制藥有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H31021610）；10%鹽酸溶液；丙烯巴比妥（內(nèi)標(biāo)液）配制成1.0mg／mL醇儲備液，置冰箱保存；其他試劑均為分析純。

1.5 動物模型 雄性Wistar大鼠12只，體重200g±20g，隨機分為LD50組和2LD50組，每組6只，實驗前隔夜禁食。經(jīng)胃勻速注入LD50（0.66mg／kg）和2LD50（1.32mg／kg）苯巴比妥。待呼吸和心跳全部消失時，迅速解剖動物，取心血、心、肝、脾、肺、腎、腦、胃等冷凍保存待檢。

1.6 樣品提取和檢測 取固體檢材1g或血1mL，加蒸餾水1mL，加入內(nèi)標(biāo)液20μL，振蕩，固性檢材超聲細胞粉碎（JYD－650L智能型）勻漿3min，10%HCl調(diào)pH2～3，振蕩搖勻，加入5mL乙醚，振蕩15min，1 800r／min離心10min，將上清液移入另一干凈且干燥試管中，重復(fù)萃取一次。40 ℃恒溫水浴中揮干，殘渣用20μL無水乙醇定容，取1μL 進樣檢測，利用保留時間結(jié)合特征離子峰（氣－質(zhì)聯(lián)用）定性，內(nèi)標(biāo)法和工作曲線法（氣相色譜）定量［7，8］。

1.7 工作曲線和回收率

1.7.1 工作曲線 取空白大鼠肝臟1g和血液1mL分別加入苯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)溶液及丙烯巴比妥溶液，配制成含有苯巴比妥0.5μg／g（μg／mL）、1μg／g、2μg／g、4 μg／g、8μg／g、10μg／g、12μg／g、16μg／g、18μg／g、20 μg／g、24μg／g、32μg／g和丙烯巴比妥20μg／g的系列樣品，按1.6項方法提取并檢測。以苯巴比妥濃度為橫坐標(biāo)（X），苯巴比妥與內(nèi)標(biāo)丙烯巴比妥的峰面積之比為縱坐標(biāo)（Y）進行線性回歸，所得肝臟線性回歸方程Y＝0.021 2X－0.000 4，r2＝0.994；血液線性回歸方程Y＝43.476X＋0.817，r2＝0.995 5。結(jié)果表明，肝臟和血液中苯巴比妥在0.1μg／g～32μg／g線性關(guān)系良好。

1.7.2 回收率 空白肝中加入苯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5μg、16μg、32μg，按1.6方法提取并檢測，工作曲線法計算檢材中苯巴比妥含量，肝中苯巴比妥的提取回收率為（95.8±2.4）%～（118.3±6.2）%。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 各組數(shù)據(jù)用SPSS 11.5軟件對組織中苯巴比妥的含量進行方差分析及t 檢驗，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示。

2 結(jié) 果

2.1 中毒癥狀 大鼠在苯巴比妥灌胃后活動明顯減少，出現(xiàn)嗜睡癥狀，LD50組灌胃7.24h±3.17h后死亡，2LD50組灌胃1.33h±0.25h后死亡。

圖1 染毒大鼠肝臟中苯巴比妥氣相色譜圖

2.2 GC和GC／MS檢測 苯巴比妥和丙烯巴比妥保留時間分別為10.45min和6.66min，峰形對稱，可完全分離，溶劑和空白臟器提取內(nèi)源性雜質(zhì)對苯巴比妥和丙烯巴比妥無干擾。詳見圖1～圖6。

圖2 染毒大鼠肝臟中苯巴比妥總離子流色譜圖

圖3 染毒大鼠肝臟中苯巴比妥質(zhì)譜圖

圖4 染毒大鼠肝臟添加內(nèi)標(biāo)物丙烯巴比妥質(zhì)譜圖

圖5 苯巴比妥的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖

圖6 丙烯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖

2.3 兩組大鼠體內(nèi)苯巴比妥的含量（見表1）

表1 苯巴比妥在大鼠體內(nèi)的死后分布 μg／g

表1 苯巴比妥在大鼠體內(nèi)的死后分布 μg／g

組別 n心血 心 肝 脾 肺 腎 腦 胃LD50組 6 269.52±44.62 305.88±70.87 282.76±79.44 272.56±31.53 277.58±67.47 156.61±43.72 271.56±71.43 1 261.34±591.83 2LD50組 6 309.93±135.6 310.95±130.73 357.83±138.67 299.77±104.58 308.28±134.48 233.24±91.92 323.19±159.92 1 649.21±1 212.82

3 討 論

本研究建立了苯巴比妥染毒大鼠的死后分布模型。不同劑量（LD50、2LD50）苯巴比妥灌胃后在7.24 h±3.17h 和1.33h±0.25h內(nèi)死亡，考慮劑量的影響，從而研究死亡當(dāng)時各臟器中藥物的分布狀態(tài)與劑量的關(guān)系。此模型簡便易復(fù)制，可應(yīng)用于苯巴比妥的法醫(yī)毒物動力學(xué)研究［10，11］。

本實驗結(jié)果顯示，各臟器組織苯巴比妥含量由高到低分別為，LD50組：胃＞心、腦、肝、肺、脾、心血＞腎（P ＜0.05）；2LD50組：胃＞肝、腦、心、心血、肺、脾＞腎（P ＜0.05）。說明苯巴比妥死后分布不均勻，主要分布于含血豐富和脂質(zhì)含量高的器官和組織中如肝、肺、心、腦。因此，藥物的死后分布特征可能與組織的血流量、脂質(zhì)含量和藥物的酸堿性、脂溶性高低有關(guān)［12－14］。其次，胃內(nèi)藥物濃度最高，說明口服途徑給藥，存在未被吸收的藥物；腎臟藥物濃度最低，說明死亡當(dāng)時藥物在體內(nèi)處于吸收分布時相，而未達到排泄時相。最后，實驗結(jié)果說明劑量對死后分布趨勢無影響。本實驗在死后分布模型的制備中未對染毒大鼠死亡時間進行控制。因此，需進一步研究死亡時間是否對死后分布結(jié)果存在影響。

對懷疑苯巴比妥中毒（死）案件進行法醫(yī)學(xué)鑒定：①心血、心、肝、肺、腦是較好的檢材，其濃度能反映中毒當(dāng)時的真實濃度，但要注意準(zhǔn)確全面的取材及死后再分布的影響。②由于胃內(nèi)有未被吸收的藥物，不適合用于推斷中毒死亡當(dāng)時的濃度，但可以推斷給藥途徑。③通過對死亡當(dāng)時各臟器的分布狀態(tài)，結(jié)合動態(tài)分布，推斷死亡時所處時相，進而推斷死亡時間。在法醫(yī)案件中判斷死亡當(dāng)時濃度、給藥途徑和死亡時間，需要考慮到各種影響因素，全面、合理的分析，得出正確的鑒定結(jié)果，為案件的偵破提供一定的依據(jù)。

［1］ 王懷良.臨床藥理學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：1－5.

［2］ 莊明潔.法醫(yī)學(xué)進展［J］.中國法醫(yī)學(xué)雜志，1988，3（4）：226.

［3］ 雷力力，方洪壯.復(fù)方苯巴比妥散中苯巴比妥的差示分光光度測定法［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，1997，9（4）：78－79.

［4］ Yukawa E，To H，Ohdo S，et al.Detection of a drug－drug interaction on population－based phenobarbitone clearance using nonlinear mixed－effects modeling［J］.Eur J Clin pharmacol，1998，54（1）：69.

［5］ 馬慧平，何曉英，葛欣.苯巴比妥栓的制備及在家兔體內(nèi)的藥物動力學(xué)［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，1998，18（8）：443－446.

［6］ 陳連劍，李婷，李成.小兒苯巴比妥分散片在家犬體內(nèi)藥代動力學(xué)與生物利用度研究［J］.廣東微量元素科學(xué)，2003，10（5）：12－15.

［7］ 張億，歐陽曉玫.氣相色譜法測定苯巴比妥及其制劑的含量［J］.色譜，1995（1）：56－57.

［8］ 張丹，姜焱.反相高效液相色譜法同時測定血漿中氯胺酮、苯巴比妥和阿托品的濃度［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，1997，17（3）：101－103.

［9］ Kushida K，Chiba K，Ishizaki T，et al.Simultaneous liquid chromatographic determination of chloramphenicol and antiepileptic drugs（phenobarbital，phenytoin，carbamazepine，and primidone）in plasma［J］.Therapeutic Drug Monitoring，1983，5（1）：127－134.

［10］ 贠克明.法醫(yī)毒物動力學(xué)［J］.中國法醫(yī)學(xué)雜志，2008，23（6）：361－369.

［11］ Yun Keming.The introducation of forensic toxicokinetics［J］.The Japanese Journal of Legal Medicine，2008，62：61.

［12］ 黃光照，汪德文.法醫(yī)毒理學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：125－126.

［13］ Rambeck B，Schnabel R，May T，et al.Postmortem concentrations of phenobarbital，carbamazepine，and its metabolite carbamazepine－10，11－epoxide in different regions of the brain and in the serum：Analysis of autoptic specimens from 51epileptic patients［J］.Ther Drug Monit，1993，15（2）：91－98.

［14］ Benk?A.Post－mortem toxicological analysis and comparison of concentrations of drugs in organs and bones［J］.Acta Pharm Hung，1985，55（4）：199－204.